CXCR4核定位與腎癌轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、腎癌作為泌尿系腫瘤中最常見的三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和腫瘤致死率一直位于全球男性惡性腫瘤最高發(fā)病率的前10位。最新的數(shù)據(jù)顯示在美國每年新增腎癌病例約61560例。腎癌一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，其預(yù)后將很差。大約有三分之一的新診斷的腎癌患者在診斷時就存在轉(zhuǎn)移，并且那些診斷時為局限性腎癌的患者中也有20％到40％會最終發(fā)展成轉(zhuǎn)移。因此，研究腎癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制，探尋影響腎癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的關(guān)鍵分子和通路，對于了解轉(zhuǎn)移性腎癌的生物學(xué)特性，明確腎癌轉(zhuǎn)移的分

2、子機制，豐富轉(zhuǎn)移性腎癌有效治療手段具有極其重要的理論意義和應(yīng)用價值。
　　目的:
　　1)研究CXCR4核定位與腎癌轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，分析CXCR4核定位對腎癌轉(zhuǎn)移的預(yù)后的影響;
　　2）研究CXCR4配體CXCL12在CXCR4核定位過程中的作用;
　　3）初步探討HIF-1 alpha和CXCR4結(jié)合并促進CXCR4的機制。探究腎癌患者HIF-1 alpha表達與CXCR4核定位的相關(guān)性，并對HIF-1 alp

3、ha與腎癌預(yù)后進行分析；
　　4）對CXCR4核定位后如何誘導(dǎo)腎癌細胞轉(zhuǎn)移的機制進行研究。
　　方法:
　　1)通過real-time PCR、提取腎癌細胞核蛋白、western blot、免疫熒光及免疫組化來檢測腎癌細胞在CXCL12刺激前后及腎癌組織中CXCR4表達情況。
　　2）通過PCR技術(shù)構(gòu)建同義突變的EGFP-CXCR4、核定位序列突變及同義突變的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)及空E

4、GFP的慢病毒，并轉(zhuǎn)染病毒后建立穩(wěn)定表達的腎癌細胞株。根據(jù)同義突變位點構(gòu)建CXCR4shRNA慢病毒并轉(zhuǎn)染腎癌細胞株，建立穩(wěn)定沉默CXCR4的腎癌細胞株，再通過轉(zhuǎn)染同義突變的EGFP-CXCR4、核定位序列突變及同義突變的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)及空EGFP的慢病毒，建立穩(wěn)定rescue的腎癌細胞株，并通過熒光顯微鏡、real-time PCR、提取腎癌細胞核蛋白、western blot鑒定。
　　3）通

5、過增殖實驗、侵襲實驗、單克隆形成實驗、凋亡實驗及裸鼠皮下荷瘤實驗研究穩(wěn)定表達EGFP-CXCR4、核定位序列突變的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)、空EGFP的腎癌細胞株的生物學(xué)功能情況。
　　4）收集98例在長海醫(yī)院泌尿外科住院手術(shù)的腎癌患者的病例信息，病理標(biāo)本，構(gòu)建腎癌的組織芯片。通過免疫組化檢測組織芯片中CXCR4核定位情況，研究其與臨床病理參數(shù)、患者預(yù)后之間的關(guān)系。
　　5）通過構(gòu)建EGFP-CXCR

6、4和pDsRed2-CXCL12質(zhì)粒并共轉(zhuǎn)染293細胞，通過熒光顯微鏡觀察CXCR4和CXCL12在細胞內(nèi)相互共定位的情況。同時通過免疫組化、免疫熒光研究腎癌細胞、腎癌組織芯片中CXCL12表達與預(yù)后之間的關(guān)系。
　　6）通過免疫共沉淀技術(shù)、核蛋白提取技術(shù)、western blot、免疫組化、免疫熒光研究HIF-1 alpha和CXCR4在腎癌細胞內(nèi)相互作用的情況。
　　7）通過HIF-1 alpha抑制劑、CXCL12及缺

7、氧培養(yǎng)對腎癌細胞株進行處理，通過western blot、核蛋白抽提技術(shù)檢測腎癌細胞株中CXCR4、HIF-1 alpha的表達情況及核定位情況。
　　8）通過免疫組化檢測組織芯片中HIF-1 alpha核定位及表達情況，研究其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后之間的關(guān)系。
　　9）通過免疫組化、western blot技術(shù)研究腎癌細胞株及腎癌病灶中Vimentin、E-cadherin、CD44等EMT相關(guān)的蛋白表達情況，研究CXCR4

8、核定位對腎癌細胞EMT的影響。
　　10)通過提取腎癌細胞核蛋白、western blot等技術(shù)研究穩(wěn)定表達EGFP-CXCR4、核定位序列突變的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)、空EGFP的腎癌細胞株中Vimentin、E-cadherin、CD44等EMT相關(guān)的蛋白表達情況，研究CXCR4核定位對腎癌細胞EMT的影響。
　　11)通過HIF-1 alpha抑制劑、缺氧培養(yǎng)、CXCL12對腎癌細胞株進行處理

9、，通過westernblot、核蛋白抽提技術(shù)檢測HIF-1核定位和CXCR4核定位誘導(dǎo)腎癌侵襲的機制。
　　結(jié)果:
　　1)經(jīng)過CXCL12刺激后腎癌細胞株ACHN中核蛋白中CXCR4蛋白逐漸增加，并在刺激24小時內(nèi)隨著時間延長CXCR4在核蛋白中的濃度逐漸增加。經(jīng)過CXCL12刺激后腎癌細胞中CXCR4蛋白在核內(nèi)表達。部分腎癌原發(fā)灶中CXCR4在細胞核內(nèi)有表達，部分腎癌原發(fā)灶中CXCR4僅在細胞漿或及細胞膜上表達，而在腎癌

10、轉(zhuǎn)移灶中CXCR4在細胞核內(nèi)表達。
　　2)對CXCR4的cDNA序列中709-726的堿基進行同義突變，將709-726的堿基序列GCCCTCAAGACCACAGTC變成GCTCTGAAAACAACCGTG，氨基酸序列均為ALKTTV。再在CXCR4同義突變的基礎(chǔ)上將氨基酸序列146-RPRK-149突變?yōu)锳AAA，即將436-447堿基AGGCCAAGGAAG突變成GCCGCTGCCGCT。將突變后的CXCR4裝入慢病毒載體，

11、測序明確突變符合要求。診斷CXCR4原709-726的堿基序列GCCCTCAAGACCACAGTC進行設(shè)計shRNA干擾，序列如下:CCGGCCCTCAAGACCACAGTCATTTCAAGAGAATGACTGTGGTCTTGAGGGTTTTTTG。并裝入shRNA表達慢病毒。將慢病毒轉(zhuǎn)染腎癌細胞株ACHN，并篩選成穩(wěn)定細胞株。real-time PCR結(jié)果顯示在EGFP-CXCR4或NLS-CXCR4過表達組中CXCR4mRNA表達明

12、顯升高。熒光顯微鏡下確認穩(wěn)定表達的細胞株中的熒光表達，EGFP-CXCR4蛋白在細胞膜、細胞漿及細胞核內(nèi)均有表達，而NLS-CXCR4蛋白在細胞膜、細胞漿內(nèi)表達。抽提細胞核蛋白進行蛋白電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn):EGFP-CXCR4蛋白在核內(nèi)有表達，而NLS-CXCR4蛋白在核內(nèi)無表達。
　　3)增殖實驗結(jié)果顯示:從第三天開始，EGFP-CXCR4組和EGFP組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異，而從第四天開始，NLS-CXCR4組和EGFP組相比具有統(tǒng)計學(xué)差

13、異。侵襲實驗結(jié)果顯示:EGFP-CXCR4組OD值最高，EGFP-CXCR4組和NLS-CXCR4組有統(tǒng)計學(xué)差異，EGFP-CXCR4組和空EGFP組及ACHN對照組有統(tǒng)計學(xué)差異。NLS-CXCR4組和空EGFP組未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異。單克隆形成實驗結(jié)果顯示: EGFP-CXCR4組形成的克隆數(shù)最多，NLS-CXCR4組其次，而空EGFP組和ACHN對照組最少。EGFP-CXCR4組和EGFP組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，NLS-CXCR4組和EG

14、FP組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，EGFP-CXCR4組和NLS-CXCR4組相比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。流式檢測凋亡結(jié)果顯示過表達空EGFP的ACHN細胞、過表達EGFP-CXCR4的ACHN細胞及過表達NLS-CXCR4的ACHN細胞的凋亡水平分別為:14.8％、5.33％和5.28％。顯示核定位突變的組凋亡有所下降。裸鼠皮下荷瘤實驗結(jié)果顯示，皮下移植腎癌細胞14天后起，EGFP-CXCR4組移植瘤和EGFP組有統(tǒng)計學(xué)差異，而EGFP-CXCR4組

15、移植瘤和NLS-CXCR4組無統(tǒng)計學(xué)差異，NLS-CXCR4組和EGFP組無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4)組織芯片顯示:CXCR4在腎癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，其中出現(xiàn)CXCR4核定位的占所有腎癌標(biāo)本中的64.7％。在腎癌患者單因素生存分析中發(fā)現(xiàn):CXCR4核定位組預(yù)后明顯差于CXCR4陰性組及CXCR4胞漿表達組。腎癌癌組織中CXCR4的表達水平與性別、年齡、癥狀、腫瘤直徑大小、腫瘤位置、T分期、N分期、M分期、AJCC腎

16、癌分期、病理類型、Fuhrman分級均無關(guān)。
　　5)通過DNA測序證實構(gòu)建pEGFP-CXCR4、pDsRed2-CXCL12質(zhì)粒成功。熒光顯微鏡下觀察通過lipofectamin3000共轉(zhuǎn)染pEGFP-CXCR4、pDsRed2-CXCL12質(zhì)粒入293細胞，發(fā)現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光均表達，且在部分293細胞中共表達，形成黃色熒光。熒光顯微鏡下觀察經(jīng)CXCL12刺激24小時后的腎癌細胞株，發(fā)現(xiàn):CXCR4在細胞核內(nèi)及細胞漿有表

17、達、CXCL12在細胞漿表達，CXCL12未在細胞核內(nèi)表達。CXCL12高表達預(yù)示腎癌預(yù)后差。
　　6)免疫組化發(fā)現(xiàn):CXCR4核定位陽性的腎癌病灶中HIF-1 alpha核定位陽性。免疫熒光顯示:CXCL12刺激24h后HIF-1 alpha在細胞核內(nèi)有表達。通過GFP-Trap試劑盒分別對高表達空EGFP、EGFP-CXCR4、NLS-CXCR4的腎癌細胞進行pulldown免疫共沉淀，并進一步進行western blot，發(fā)

18、現(xiàn)HIF-1 alpha在EGFP-CXCR4組及NLS-CXCR4組有表達，而在空EGFP組無表達。
　　7)western blot實驗發(fā)現(xiàn):HIF-1 alpha抑制劑處理后HIF-1 alpha在腎癌細胞核內(nèi)表達明顯減少，CXCR4在腎癌細胞核內(nèi)表達也明顯減少。在腎癌細胞缺氧培養(yǎng)后HIF-1 alpha表達明顯升高。在CXCL12刺激后，HIF-1 alpha核定位明顯增加。
　　8)組織芯片顯示:HIF-1 alp

19、ha在腎癌的表達情況和腎癌患者預(yù)后成負相關(guān)，且HIF-1 alpha核定位組的腎癌患者預(yù)后最差。HIF-1 alpha表達和腎癌灶的細胞增殖水平、腫瘤直徑大小明顯相關(guān)。HIF-1 alpha表達水平與腎癌患者的年齡、性別、腫瘤的位置、Fuhrman分級、TNM分期等無明顯相關(guān)。HIF-1 alpha核定位和CXCR4核定位、CXCL12表達存在相關(guān)性，具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　9)免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn):相對于CXCR4核定位陰性組，CXC

20、R4核定位陽性的腎癌灶中Vimentin、caspase-3水平低表達，E-cadherin水平高表達，CD44高表達，NF-kappa B高表達，PCNA高表達，Ki-67、CD105高表達。Western blot結(jié)果顯示:在缺氧誘導(dǎo)下，腎癌細胞中HIF-1 alpha表達增加，CXCR4核定位增加，E-cadherin表達增高、Vimentin表達降低、CD44表達增加。CXCL12刺激后腎癌細胞中E-cadherin的mRNA表

21、達增加，Vimentin基因表達減少，且能被CXCR4受體拮抗劑AMD3100所抑制。CXCL12及缺氧可以增加腎癌細胞侵襲能力，AMD3100及HIF-1 alpha抑制劑可以抑制腎癌細胞的侵襲能力。蛋白電泳結(jié)果顯示:腎癌細胞CXCR4核定位序列突變后E-cadherin表達增加，而Vimentin表達減少。
　　結(jié)論:
　　1) CXCL12和腎癌細胞的CXCR4結(jié)合后促進了CXCR4蛋白的核轉(zhuǎn)位。腎癌原發(fā)灶中部分患者出

22、現(xiàn)CXCR4核定位，腎癌轉(zhuǎn)移灶中CXCR4核定位明顯。腎癌灶中CXCR4核定位與患者癥狀、腫瘤TNM分期、增殖水平、病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等無明顯相關(guān)，CXCR4核定位預(yù)示腎癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加，預(yù)后不良。
　　2）CXCR4核定位序列為146-RPRK-149，將其突變后的CXCR4蛋白無法在細胞核內(nèi)表達。CXCR4核定位缺失后增殖、侵襲、單克隆形成、裸鼠皮下成瘤能力能力明顯下降。CXCL12在和CXCR4結(jié)合后可能形成復(fù)合體進入細胞漿。

23、CXCL12未在細胞核內(nèi)表達。
　　3）HIF-1alpha在細胞漿內(nèi)和CXCR4相互作用，可能參與了CXCR4的核定位。HIF-1 alpha核定位出現(xiàn)在部分腎癌原發(fā)灶中，腎癌灶中HIF-1 alpha核定位與患者腫瘤大小、增殖水平、病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等明顯相關(guān)，預(yù)示腎癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加，預(yù)后不良。
　　4）HIF-1 alpha作為CXCR4入核過程中的重要靶點蛋白和CXCR4結(jié)合，是缺氧環(huán)境下促進腎癌細胞CXCR4核定位的