CXCR4在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、目的和意義： 鼻咽癌轉(zhuǎn)移是影響鼻咽癌患者預(yù)后及生存率的主要因素。文獻報道，臨床上確診鼻咽癌病例中有60％以上已有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移，約有1/3患者初診時即以轉(zhuǎn)移癥狀就診；一旦發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，患者中位生存期不超過1年。因此，研究鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找治療靶點，對提高鼻咽癌治療療效，延長病人生命有重要的臨床指導(dǎo)意義。 趨化因子受體-4是目前研究較深入的趨化因子受體，主要由炎性細胞和腫瘤細胞分泌，文獻報道CXCR4在多種

2、惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用，但其在鼻咽癌中的作用目前鮮有研究。 本實驗擬研究CXCR4在不同轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌組織及鼻咽癌細胞株的表達情況，探討CXCR4在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用及其與鼻咽癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、分化程度的相關(guān)性；研究鼻咽癌組織中CXCR4和LMP-1作用通路的相關(guān)性；探討SDF-1a/CXCR4在鼻咽癌細胞趨向遠處靶器官轉(zhuǎn)移中的作用。 方法： 1.臨床標本收集及實驗分組 收集20

3、06年10月至2007年4月確診的鼻咽癌組織和健康志愿者的鼻咽組織，共45例，包括30例鼻咽癌組織和15例正常鼻咽組織。鼻咽癌易轉(zhuǎn)移的遠處靶器官組織和不易轉(zhuǎn)移的遠處靶器官組織，其中頸淋巴結(jié)標本來自鼻咽癌患者，其它標本取自因相應(yīng)器官腫瘤而手術(shù)切除的距腫瘤安全切緣3cm以外的器官組織。所有標本均行HE染色證實無癌細胞浸潤。 2.鼻咽癌細胞株的培養(yǎng) EB病毒陽性的人類低分化鼻咽癌細胞株C666-1，有轉(zhuǎn)移能力的鼻咽癌細胞株5-

4、8F和無轉(zhuǎn)移能力的鼻咽癌細胞株6-10B，高分化鼻咽癌細胞株CNE-1和Hone-1，低分化鼻咽癌細胞株CNE-2，EB病毒轉(zhuǎn)化的絨猴B淋巴細胞B95-8為本科室保存。所有細胞均培養(yǎng)于37℃、100％濕度、5％CO2環(huán)境中，用0.25％胰蛋白酶消化傳代，以含15％FBS的RP1640培養(yǎng)液隔天換液。 3.RT-PCR 按常規(guī)法提取組織及細胞株的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成CDNA后根據(jù)引物序列PCR擴增。所有PCR產(chǎn)物在加入溴乙錠

5、的1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，紫外線下照相后采用凝膠圖像分析軟件作條帶密度掃描，結(jié)果以CXCR4/GAPDH和LMP-1/GAPDH的灰度對數(shù)比值分別表示CXCR4mRNA和LMP-1mRNA的相對表達強度。 4.IHC檢測 待檢組織的石蠟切片按SP免疫組化三步法進行染色，光鏡下觀察顯色結(jié)果。采用Bresalier半定量公式稍加修改判斷染色結(jié)果：切片在10倍物鏡視野下觀察，隨機計數(shù)5個視野中各細胞的染色強度，根據(jù)細胞染色強

6、度分為四級，并分別計分：陰性，細胞無著色；弱陽性，細胞著色為淺黃色；中度陽性，細胞著色為棕黃色；強陽性，細胞著色為棕褐色，計算每一強度的視野數(shù)，根據(jù)下列公式計算每張切片的平均染色強度=∑{(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)}，F(xiàn)i=％10×視野數(shù)。 5.統(tǒng)計學(xué)分析 所有計量資料結(jié)果用x±s表示，不同組別LMP-1mRNA和CXCR4mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；同一患

7、者鼻咽癌原發(fā)灶和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中LMP-1蛋白表達的比較、CXCR4蛋白表達的比較采用兩相關(guān)樣本的非參數(shù)檢驗，其余免疫組化結(jié)果的比較均采用Kruskal-Wallis檢驗。mRNA表達水平之間的相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)，蛋白表達水平之間的相關(guān)性分析采用Sperman等級相關(guān)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。 結(jié)果 1.CXCR4和LMP-1在正常鼻咽組織及

8、鼻咽癌組織的表達 RT-PCR檢測結(jié)果顯示正常鼻咽組織、無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織、伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織CXCR4mRNA表達水平分別為0.185±0.126，0.631±0.287，0.856±0.299，使用單因素方差分析、LSD多重比較方法的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示差異有顯著性意義，伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者最高，正常鼻咽組織最低；IHC檢測結(jié)果顯示正常鼻咽組織、無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織、伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織CXCR4蛋白表達強度(以

9、平均秩次表示)分別為9.47，21.79，36.75，Kruskal-Wallis檢驗結(jié)果示差異有顯著性意義，伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者最高，正常鼻咽組織最低。CXCR4mRNA和蛋白表達水平同鼻咽癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著正相關(guān)，同細胞的分化程度顯著負相關(guān)。15例先后行鼻咽部和頸部淋巴結(jié)活檢并明確診斷為癌和癌轉(zhuǎn)移的患者，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中CXCR4蛋白表達強度高于相應(yīng)鼻咽癌原發(fā)灶，兩相關(guān)樣本的非參數(shù)檢驗果示差異有顯著性意義。 RT

10、-PCR檢測結(jié)果顯示正常鼻咽組織、無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織、伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織LMP-1mRNA表達水平分別為0.541±0.284，0.637±0.288，0.966±0.198，使用單因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果示差異有顯著性意義，LSD多重比較統(tǒng)計結(jié)果示除正常鼻咽組織與無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織之間無顯著性差異外，其余各組之間差異均有顯著性意義，以伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者最高，正常鼻咽組織最低。IHC檢測結(jié)果顯示正常鼻咽組織、無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

11、移鼻咽癌組織、伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織LMP-1蛋白表達強度分別為11.83，19.46，36.56，Kruskal-Wallis檢驗結(jié)果示差異有顯著性意義，伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者最高，正常鼻咽組織最低。LMP-1mRNA和蛋白表達同鼻咽癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著正相關(guān)，同細胞的分化程度無顯著相關(guān)性。15例先后行鼻咽部和頸部淋巴結(jié)活檢并明確診斷為癌和癌轉(zhuǎn)移的患者，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中LMP-1蛋白表達強度高于相應(yīng)鼻咽癌原發(fā)灶，兩相關(guān)樣本的

12、非參數(shù)檢驗結(jié)果示差異有顯著性意義。 2.CXCR4和LMP-1在鼻咽癌細胞株的表達 RT-PCR結(jié)果示鼻咽癌細胞株C666-1、5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2中CXCR4mRNA的表達水平分別為0.974±0.015、0.836±0.023、0.648±0.013、0.642±0.026、0.628±0.019，Hone-1無CXCR4mRNA的表達；單因素方差分析及LSD多重比較結(jié)果示6-10B和CNE-

13、1之間無顯著性差異，6-10B和CNE-2之間無顯著性差異，CNE-1和CNE-2之間無顯著性差異，其余各組之間CXCR4mRNA表達水平均有顯著性差異。其中C666-1中CXCR4mRNA表達水平最高，CNE-2最低；巢式PCR結(jié)果示僅C666-1有LMP-1mRNA的表達，5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2、Hone-1均無LMP-1mRNA的表達，C666-1中CXCR4mRNA和LMP-1mRNA的表達水平存在顯著相關(guān)

14、性。 3、鼻咽癌中CXCR4和LMP-1表達的相關(guān)性 Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果示鼻咽癌組織中CXCR4mRNA和LMP-1mRNA的表達水平存在顯著相關(guān)性；正常鼻咽組織CXCR4mRNA和LMP-1mRNA的表達水平無顯著相關(guān)性。Sperman等級相關(guān)分析結(jié)果示鼻咽癌組織中CXCR4蛋白和LMP-1蛋白的表達水平存在顯著相關(guān)性，但正常鼻咽組織CXCR4蛋白和LMP-1蛋白的表達水平無顯著相關(guān)性。rAAV-shRNA

15、-LMP-1轉(zhuǎn)染至C666-1細胞抑制LMP-1的表達后，C666-1中CXCR4mRNA的表達顯著下調(diào)但仍有低水平表達。 4、SDF-1a蛋白在鼻咽癌遠處靶器官的表達 Kruskal-Wallis檢驗統(tǒng)計分析結(jié)果示鼻咽癌易轉(zhuǎn)移的正常頸部淋巴結(jié)、肺、骨髓、肝臟中SDF-1a蛋白表達強度(以平均秩次表示)分別為20.80，22.40，20.60，17.20，而不易轉(zhuǎn)移的腎臟和結(jié)腸中SDF-1a蛋白表達強度分別為6.40，5

16、.60，兩組之間差異有顯著性意義(X2=19.759，P=0.001)，鼻咽癌易轉(zhuǎn)移的遠處靶器官SDF-1a蛋白表達水平較高。 結(jié)論： 1.正常鼻咽組織、無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織、伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織存在CXCR4mRNA和蛋白表達，其表達水平依次顯著升高。 2.鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中CXCR4蛋白的表達水平顯著高于相應(yīng)的原發(fā)灶。 3.CXCR4mRNA和蛋白的表達水平與鼻咽癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀

17、態(tài)呈正相關(guān)，與癌細胞的分化程度呈負相關(guān)。 4.鼻咽癌組織中CXCR4和LMP-1mRNA和蛋白的表達均顯著相關(guān)。 5.鼻咽癌細胞株C666-1、5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2均不同程度表達CXCR4mRNA，其中C666-1表達水平最高，CNE-2最低；但上述細胞株中僅C666-1表達LMP-1mRNA，C666-1中CXCR4mRNA和LMP-1mRNA的表達顯著相關(guān)。 6.轉(zhuǎn)染rAAV-shRN