Capn4在鼻咽癌惡性生物學(xué)行為中的作用與機(jī)制.pdf

1、鼻咽癌是起源于鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)病率具有明顯的地域分布特征，在東南亞地區(qū)和中國南方有極高的發(fā)病率，年發(fā)病率為20-30/10萬。根據(jù)國際癌癥研宄署的全球惡性腫瘤的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示2008年新發(fā)鼻咽癌病人超過84,000人，其中80％在亞洲，5%在歐洲。病因?qū)W研宄顯示鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染、種族背景、飲食習(xí)慣、喝酒和環(huán)境因素相關(guān)。現(xiàn)在，隨著影像診斷、放療技術(shù)的進(jìn)步和聯(lián)合放化療的應(yīng)用，使鼻咽癌局部病灶得到更好的控制。然而，多數(shù)鼻咽癌

2、患者在初次診斷時(shí)已為晚期，其治療效果還不盡如人意，Ⅲ期和Ⅳ期患者的5年生存率分別為53%-80%、28%-61%。因此，努力更好地理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的特異性治療靶點(diǎn)，在鼻咽癌早期診斷、個(gè)體化治療治療、預(yù)后中顯得尤為重要。
　　Calpain是Ca2+依賴的半胱氨酸蛋白水解酶家族。至今，在人類已鑒定14個(gè)家族成員，大部分成員與細(xì)胞粘附相關(guān)，參與細(xì)胞的伸展、迀移、增殖、細(xì)胞周期的的調(diào)控和凋亡等。Capn4(又稱為Cap

3、n4S1)是calpain蛋白的一個(gè)小分子調(diào)節(jié)亞基，在調(diào)節(jié)calpain的穩(wěn)定性和活性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。多項(xiàng)研宄表明Capn4的缺失引起calpain-1和calpain-2功能障礙。在轉(zhuǎn)基因小鼠中的研宄顯示敲除Capn4基因可顯著降低calpain活性，從而影響小鼠的正常發(fā)育，導(dǎo)致胚胎早期死亡；KnockdownCapn4降低成纖維細(xì)胞的迀移和粘附能力。最近的研宄報(bào)道Capn4在肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌中高表達(dá)，而且Capn

4、4表達(dá)程度與患者的預(yù)后密切相關(guān)。干擾Capn4的表達(dá)能夠顯著降低肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌的細(xì)胞侵襲和迀移能力。由此，推測(cè)Capn4在轉(zhuǎn)移癌的細(xì)胞迀移和粘附中發(fā)揮一定的作用，其在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中是否發(fā)揮類似的作用尚不清楚。
　　目的:
　　1、研究Capn4在鼻咽癌中的表達(dá)情況，及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系；2、探討Capn4在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及潛在的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1、分別應(yīng)用RT-PCR

5、和Western-blot方法檢測(cè)Capn4在新鮮活檢鼻咽癌組織及鼻咽癌細(xì)胞系中的mRNA和蛋白表達(dá)水平；2、免疫組化分析Capn4在鼻咽癌組織中的表達(dá)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系；3、構(gòu)建Capn4siRNA，應(yīng)用transwell實(shí)驗(yàn)和裸鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)分析Capn4對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、CNE2體內(nèi)外侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響；4、Westernblot分析Capn4對(duì)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的影響；6、分別應(yīng)用RT-PCR和明膠

6、酶譜法分析MMP2的mRNA表達(dá)情況和酶活性；7、上調(diào)、下調(diào)MMP2的表達(dá)，transwell實(shí)驗(yàn)觀察MMP2對(duì)Capn4調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響；8、Westernblot分析NF-kBp65的磷酸化情況；9、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)分析Capn4對(duì)鼻咽癌細(xì)胞在體內(nèi)外增殖能力的影響；10、流式細(xì)胞儀分析Capn4對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期的影響；11、Westernblot分析Capn4對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白的影響。

7、r>　　結(jié)果:
　　1、Capn4在鼻咽癌組織中的表達(dá)顯著高于正常鼻咽組織無論是在mRNA水平還是在蛋白水平，新鮮細(xì)針穿刺活檢鼻咽癌組織（7例）中的Capn4表達(dá)要明顯高于正常鼻咽組織（2例）。同樣，Capn4在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F,、CNE2、6-10B的表達(dá)明顯高于永生化的正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69。我們進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量收集了183例的石蠟組織，其中153例鼻咽癌組織，30例非癌鼻咽組織，應(yīng)用免疫組化進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果：顯示C

8、apn4在鼻咽癌組織中的表達(dá)高于非癌鼻咽組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示Capn4的表達(dá)強(qiáng)度與EB病毒感染、鼻咽癌組織的浸潤深度、分化程度、TNM分期及是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。即EB病毒感染者Capn4陽性表達(dá)率高于無EB病毒感染；腫瘤分化程度越高，Capn4的陽性表達(dá)率越低；腫瘤分期越晚，Capn4的陽性表達(dá)率越高；出現(xiàn)遠(yuǎn)處及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率要明顯高于未轉(zhuǎn)移的，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

9、01)。Kaplan-Meier生存期分析顯示Capn4在鼻咽癌中表達(dá)的程度與鼻咽癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，Capn4高表達(dá)的患者總生存期、無進(jìn)展生存期均低于低表達(dá)者(^=0.002,P=0.003)。
　　2、下調(diào)Capn4的表達(dá)能夠在體內(nèi)外降低鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力
　　成功構(gòu)建了兩對(duì)Capn4小干擾RNA(Capn4/siRNA-1andCapn4/siRNA-2)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染5-8F、CNE2鼻咽癌細(xì)胞系。RT-PCR

10、和Westernblot分析顯示與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Capn4/siRNA-1、Capn4/siRNA-2的細(xì)胞內(nèi)Capn4mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低。Transwell和裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)外證實(shí)轉(zhuǎn)染Capn4/siRNA細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力顯著低于對(duì)照細(xì)胞，結(jié)果顯示：對(duì)照組出現(xiàn)7/10例肝肺轉(zhuǎn)移，而注射轉(zhuǎn)染Capn4/siRNA細(xì)胞的裸鼠只出現(xiàn)1/10的肝轉(zhuǎn)移和2/10例的肺轉(zhuǎn)移。
　　3、Capn4通過上調(diào)MMP2的

11、表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移為深入研宄Capn4調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的分子機(jī)制，Westernblot結(jié)果表明siRNA下調(diào)Capn4的表達(dá)能夠引起MMP2、Snail和Vimentin的低表達(dá)，E-cadherin的高表達(dá)，但對(duì)MMP9、N-cadherin和P-catenin的表達(dá)沒有影響。RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染Capn4/siRNA能引起鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)MMP2mRNA表達(dá)的下調(diào)；明膠酶譜檢測(cè)MMP2的酶活性也顯示在5-8F、CN

12、E2兩個(gè)細(xì)胞系內(nèi)下調(diào)Capn4的表達(dá)均能引起MMP2酶活性的降低。為了確定Capn4是否是通過誘導(dǎo)MMP2的表達(dá)來調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的迀移和侵襲，我們首先應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞系MMP2的表達(dá)，然后觀察細(xì)胞的迀移和侵襲能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：下調(diào)MMP2的表達(dá)能引起5-8F、CNE2細(xì)胞的迀移和侵襲能力下降，且其下降程度與siRNACapn4細(xì)胞相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后在抑制鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)Capn4表達(dá)的基礎(chǔ)上，過表達(dá)MMP2的表達(dá)

13、，觀察細(xì)胞的迀移和侵襲能力，結(jié)果顯示：在5-8F、CNE2細(xì)胞系中外源性過表達(dá)MMP2后均能夠恢復(fù)siRNACapn4所引起的細(xì)胞迀移和侵襲能力的下降。
　　4、Capn4調(diào)節(jié)MMP2的表達(dá)是通過NF-kB的活化
　　有研宄報(bào)道在肝細(xì)胞癌中NF-kB是Capn4促細(xì)胞轉(zhuǎn)移的下游效應(yīng)分子，此外，在即往的多個(gè)研宄中發(fā)現(xiàn)NF-kB能夠上調(diào)MMP2的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，我們就設(shè)想Capn4在鼻咽癌細(xì)胞系中上調(diào)MMP2的表

14、達(dá)是否也是通過活化NF-kB來完成的。Westernblotting分析顯示siRNA下調(diào)Capn4的表達(dá)后能顯著降低細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65的磷酸化；相反，外源性的過表達(dá)Capn4后能增加細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65的磷酸化。最后我們應(yīng)用NF-kB抑制劑helenalin抑制NF-kB的活性，觀察細(xì)胞內(nèi)MMP2的表達(dá)變化，結(jié)果顯示不管是過表達(dá)Capn4還是knockdownCapn4，細(xì)胞在應(yīng)用helenalin抑制劑后，細(xì)胞內(nèi)MMP2的表達(dá)

15、水平與對(duì)照細(xì)胞相比，均有明顯的下降，該結(jié)果表明抑制NF-kB的活性能夠抑制Capn4對(duì)MMP2表達(dá)的誘導(dǎo)。
　　5、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Capn4促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖Westernblot分析顯示與親本細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞相比，5-8F/siRNA、CNE2/siRNA細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞增殖標(biāo)志PCNA蛋白的表達(dá)明顯降低。緊接著，我們應(yīng)用CCK8實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察Capn4對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體外增殖能力的影響，下調(diào)Capn4的表達(dá)可使鼻咽癌細(xì)胞5-8F、CN

16、E2生長能力下降，與親本細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示：與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照細(xì)胞系相比，轉(zhuǎn)染小干擾RNA的5-8F、CNE2細(xì)胞其克隆形成數(shù)明顯下降(P<0.05)。我們進(jìn)一步觀察下調(diào)Capn4的表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤的影響，與注射轉(zhuǎn)染空載體5-8F/Control細(xì)胞相比，注射5-8F/siRNA1細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)腫瘤增長相對(duì)緩慢，腫瘤體積明顯小于對(duì)照組（P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提取裸

17、鼠體內(nèi)移植瘤的蛋白組織行Western-blot分析，結(jié)果顯示：第六周時(shí)，轉(zhuǎn)染小干擾RNA在體內(nèi)仍可有效地抑制細(xì)胞內(nèi)Capn4的表達(dá)。
　　6、抑制Capn4的表達(dá)能夠阻滯鼻咽癌細(xì)胞周期進(jìn)展為進(jìn)一步探討Capn4促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞DNA的含量，結(jié)果顯示：與對(duì)照5-8F/Control細(xì)胞（51.2±1.1%)相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Capn4/siRNA1和Capn4/siRNA2的鼻咽癌細(xì)胞5-8FG

18、1期DNA含量（68.5±1.7%;60.7±1.3%)明顯增加，S期DNA含量明顯減少，P<0.05。為了進(jìn)一步觀察Capn4影響鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力，是否是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控分子的表達(dá)。我們應(yīng)用Westernblot檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)分子CyclinD1、CyclinD2、CyclinE、CDK2、CDK4、P27、P57、P21的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：下調(diào)Capn4的表達(dá)，引起CyclinD1、CyclinD2、CyclinE

19、的表達(dá)降低和P27表達(dá)的增多，而CDK2、CDK4、P57、P21的表達(dá)沒有變化。
　　結(jié)論:
　　1、Capn4在鼻咽癌組織中的表達(dá)要顯著高于正常鼻咽組織，Capn4在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平與EB病毒的感染、組織的分化程度、TNM分期、腫瘤的體積以及是否出現(xiàn)淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；2、用小干擾RNA下調(diào)Capn4的表達(dá)可以明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖和成瘤能力；3、Capn4促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲，可能是依賴N