TIPE3調(diào)控PDAC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的機(jī)制研究.pdf

1、本研究首次探討TIPE3對胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，有助于深入理解PDAC惡性進(jìn)展的分子生物學(xué)機(jī)制。本研究初步探討胰腺癌細(xì)胞中TIPE3和MMP-9基因表達(dá)，以及在該過程中二者的關(guān)系，是否協(xié)同參與以及在胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中各自的作用。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 TIPE3蛋白在PDAC中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義

2、r>　　目的：
　　分析PDAC組織與癌旁正常組織標(biāo)本中TIPE3蛋白的表達(dá)情況，并結(jié)合患者的臨床病理資料分析TIPE3蛋白在PDAC中的表達(dá)特征，探討其在PDAC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。
　　方法：
　　應(yīng)用免疫組化2-step plus(@)法分別檢測78例PDAC及78例相應(yīng)癌旁組織中TIPE3蛋白的表達(dá)情況，觀察其與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，采用SPSS計算機(jī)統(tǒng)計軟件分析腫瘤及癌旁正常組織中TIPE3蛋白的表

3、達(dá)差異，并結(jié)合臨床病理特征分析TIPE3蛋白的表達(dá)與病人年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　TIPE3蛋白在PDAC組織中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織，差異具統(tǒng)計學(xué)意義;TIPE3蛋白在不同年齡、性別患者的PDAC組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)差異;TIPE3蛋白在Ⅰ、Ⅱ期PDAC組織中的表達(dá)顯著低于Ⅲ、Ⅳ期PDAC組織，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PDAC組織中表達(dá)顯著低于有淋巴轉(zhuǎn)移的PDAC組

4、織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、PDAC組織TIPE3蛋白表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織，且與PDAC淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān);
　　2、提示TIPE3可能參與了PDAC的發(fā)生、發(fā)展過程。
　　3、進(jìn)一步基因水平的研究有助于尋找PDAC更佳的診斷和治療方法。
　　第二部分 TIPE3對PDAC細(xì)胞增值、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響
　　目的：
　　探討TIPE3對PDAC細(xì)胞增值、侵襲及轉(zhuǎn)移在

5、mRNA和蛋白質(zhì)水平上表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1、首先用quantitative Real-time PCR技術(shù)在8種胰腺癌細(xì)胞株中篩選出TIPE3高表達(dá)細(xì)胞株和低表達(dá)細(xì)胞株，為后續(xù)實驗做好準(zhǔn)備;
　　2、quantitative Real-time PCR技術(shù)檢測在mRNA水平上TIPE3的表達(dá)效果;
　　3、western blot實驗檢測在蛋白質(zhì)水平上TIPE3的表達(dá)效果;
　　4、CCK8實驗

6、檢測對PDAC細(xì)胞增殖能力的影響;
　　5、Transwell實驗檢測對PDAC細(xì)胞遷移能力及侵襲能力的影響;
　　結(jié)果:
　　1、TIPE3在胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、Capan-1、CFPAC-1及AsPC-1中的表達(dá)檢測
　　通過quantitative Real-time PCR技術(shù)檢測8種胰腺癌細(xì)胞系中TIPE3的表達(dá)情況，選取TIPE3表達(dá)最高的兩種細(xì)胞系PANC-1及Capan-1和TIPE3表達(dá)最

7、低的兩種細(xì)胞系CFPAC-1及AsPC-1，為后續(xù)TIPE3高表達(dá)胰腺癌細(xì)胞系和TIPE3低表達(dá)細(xì)胞系分別進(jìn)行TIPE3干擾實驗TIPE3過表達(dá)實驗做準(zhǔn)備。
　　2、在高表達(dá)TIPE3的胰腺癌細(xì)胞PANC-1及Capan-1中干擾TIPE3的表達(dá)，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。
　　干擾TIPE3后，quantitative Real-time PCR技術(shù)檢測在mRNA水平上TIPE3的表達(dá)效果，與正常胰腺細(xì)胞相比，可

8、見胰腺癌細(xì)胞TIPE3表達(dá)明顯減少;而干擾TIPE3后，western blot實驗檢測在蛋白質(zhì)水平上TIPE3的表達(dá)效果，與正常胰腺細(xì)胞相比，可見胰腺癌細(xì)胞T1PE3表達(dá)明顯減少。此兩項實驗從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上均驗證了干擾TIPE3后，均可明顯降低胰腺癌細(xì)胞TIPE3的表達(dá)水平。干擾TIPE3后，CCK8實驗檢測對PANC-1細(xì)胞和Capan-1細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果表明，與正常胰腺細(xì)胞相比較，干擾TIPE3可顯著抑制PAN

9、C-1細(xì)胞和Capan-1細(xì)胞的增殖能力。干擾TIPE3后，Transwell實驗檢測對PANC-1細(xì)胞和Capan-1細(xì)胞遷移能力及侵襲能力的影響，結(jié)果表明，與正常胰腺細(xì)胞相比較， PANC-1細(xì)胞和Capan-1細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯減弱。
　　3、在低表達(dá)TIPE3的胰腺癌細(xì)胞CFPAC-1及AsPC-1中過表達(dá)TIPE3，可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡行生物學(xué)行為。
　　過表達(dá)TIPE3后， quantitative Re

10、al-time PCR技術(shù)檢測在mRNA水平上TIPE3的表達(dá)效果，與正常胰腺細(xì)胞相比，胰腺癌細(xì)胞TIPE3表達(dá)顯著增加;而過表達(dá)TIPE3后， western blot實驗檢測在蛋白質(zhì)水平上TIPE3的表達(dá)效果，與正常胰腺細(xì)胞相比，胰腺癌細(xì)胞TIPE3表達(dá)明顯增加。過表達(dá)TIPE3后，CCK8實驗檢測對CFPAC-1細(xì)胞和Capan-1細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果表明，與正常胰腺細(xì)胞相比較，過表達(dá)TIPE3可顯著增加CFPAC-1細(xì)胞和A

11、sPC-1細(xì)胞的增殖能力。過表達(dá)TIPE3后，Transwell實驗檢測對CFPAC-1細(xì)胞和AsPC-1細(xì)胞遷移能力及侵襲能力的影響，結(jié)果表明，與正常胰腺細(xì)胞相比較，過表達(dá)TIPE3后CFPAC-1細(xì)胞和AsPC-1細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　本部分旨在研究TIPE3對PDAC細(xì)胞增值、侵襲及轉(zhuǎn)移在mRNA和蛋白質(zhì)水平上表達(dá)的影響，首先通過quantitative Real-time PCR技術(shù)在8種胰

12、腺癌細(xì)胞系中選取TIPE3表達(dá)最高的兩種細(xì)胞系PANC-1及Capan-1進(jìn)行TIPE3干擾實驗，TIPE3表達(dá)最低的兩種細(xì)胞系CFPAC-1及AsPC-1進(jìn)行TIPE3過表達(dá)實驗。然后通過CCK8實驗、Transwell實驗、quantitative Real-time PCR技術(shù)及western blot實驗等四種方法分別進(jìn)行檢驗TIPE3對PDAC細(xì)胞增值、侵襲及轉(zhuǎn)移在mRNA和蛋白水平上的干擾和過表達(dá)效果。本部分結(jié)果顯示，TIP

13、E3可明顯促進(jìn)PDAC細(xì)胞增值、侵襲及轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步豐富了TIPE3的理論知識，并為下一步研究TIPE3調(diào)控PDAC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分 TIPE3和MMP-9在PDAC細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性研究
　　目的:
　　探討TIPE3和MMP-9在PDAC細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)性，初步探討TIPE3調(diào)控PDAC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.real-time PCR檢測在

14、mRNA水平上MMP-2，MMP-3,MMP-9的變化情況;
　　2.ELISA檢測蛋白質(zhì)水平細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2,MMP-3，MMP-9的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、TIPE3在mRNA水平顯著上調(diào)MMP-9表達(dá)。
　　在高表達(dá)TIPE3的胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞和Capan-1細(xì)胞中，干擾TIPE3表達(dá)后，real-time PCR檢測在mRNA水平上MMP-2，MMP-3，MMP-9的變化情況，

15、結(jié)果表明，相比較正常胰腺細(xì)胞，干擾TIPE3表達(dá)可明顯抑制MMP-9的表達(dá)水平;在低表達(dá)TIPE3的胰腺癌細(xì)胞系CFPAC-1細(xì)胞和AsPC-1細(xì)胞中，過表達(dá)TIPE3后，real-time PCR檢測在mRNA水平上MMP-2，MMP-3，MMP-9的變化情況，結(jié)果表明，與正常胰腺細(xì)胞相比較，過表達(dá)TIPE3可顯著增加MMP-9的表達(dá)水平。
　　2、TIPE3在蛋白質(zhì)水平明顯上調(diào)MMP-9表達(dá)。
　　在高表達(dá)TIPE3胰腺

16、癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞和Capan-1細(xì)胞中，干擾TIPE3表達(dá)后，ELISA檢測蛋白質(zhì)水平細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2，MMP-3，MMP-9的變化情況，結(jié)果表明，與正常胰腺細(xì)胞比較，干擾TIPE3表達(dá)后，可顯著抑制MMP-9蛋白的表達(dá)水平;在低表達(dá)TIPE3胰腺癌細(xì)胞系CFPAC-1細(xì)胞和AsPC-1細(xì)胞中，過表達(dá)TIPE3后，ELISA檢測蛋白質(zhì)水平細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2,MMP-3，MMP-9的變化情況，結(jié)果表明，與正常胰腺細(xì)胞

17、比較，過表達(dá)TIPE3后，可明顯增加MMP-9蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　本部分研究認(rèn)為在胰腺癌細(xì)胞中，TIPE3可顯著增強(qiáng)MMP-9活性，同時，MMP-9蛋白水解細(xì)胞外基質(zhì)會使TIPE3釋放入腫瘤侵入組織的接觸點。因此，在胰腺癌細(xì)胞中，TIPE3增加MMP-9的活性可能對腫瘤的侵襲形成正反饋。TIPE3也可能通過加強(qiáng)MMP-9活性，增加MMP-9對細(xì)胞外基質(zhì)的降解。TIPE3與MMP-9之間的相互作用可能在胰腺癌細(xì)胞