Lgr5-Wnt-β-catenin信號通路對胃癌干樣細胞惡性生物學行為的影響及其分子調控機制研究.pdf

1、近年來，有研究表明作為新的干細胞標記物，Lgr5與Wnt/β-catenin共同組成了重要的信號通路，對腫瘤干細胞生物學活性的調控也起著重要的作用。然而，有關該通路與胃癌干細胞方面的研究，卻罕有報道。前期的相關研究表明該通路關鍵蛋白在胃癌細胞中的表達高于普通胃細胞，Lgr5與胃癌的惡性程度及微血管的密度呈正相關。因此，Lgr5-Wnt/β-catenin通路是否參與胃癌干樣細胞的活性調控，是否通過調節(jié)相關蛋白的表達維持了胃癌干樣細胞的惡

2、性生物學行為仍需進一步研究。本實驗擬通過RNAi技術阻斷該通路，觀察干擾后胃癌干樣細胞生物學特性以及相關靶基因的表達變化，并利用CCK8、annexinⅤ標記、流式細胞儀等方法綜合分析胃癌干樣細胞的增殖、凋亡以及血管生成、氧代謝等生物學行為改變情況。借此尋找一個全新的胃癌干細胞研究靶點，為今后開展胃癌生物治療奠定基礎。
　　由于胃癌干細胞缺乏特異性分子標記物，因此，確切地說，各個研究所得到的應是富集胃癌干細胞的干樣細胞。目前CD4

3、4是普遍接受的胃癌干細胞分子標記物，然而，CD44單獨分選出的胃癌懸浮球細胞的干性較差，并不具有明顯的優(yōu)勢，因此亟待一個新的分子標記物的出現來提高分選所得細胞的干細胞特性。CD24、CD133、Tff2等分子雖有一定作用，然而卻缺乏特異性。近來，CD54被認為是胃癌干細胞的分子標記物，CD44+CD54+的胃癌細胞具有更高的成瘤率和增殖能力。這為提高胃癌干樣細胞的富集度提供了條件。
　　在本研究中，首先進行胃癌干樣細胞提純研究。隨

4、機選取四種人胃癌細胞系（AGS、BGC-823、MKN-28、MKN-45）進行懸浮球細胞培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代后使用流式細胞儀分選出分子標記物為CD44+CD54+的實驗組懸浮球細胞和CD44+CD54-的對照組懸浮球細胞。并通過懸浮球形成、平板克隆、增殖檢測、抗化療藥物及裸鼠成瘤等實驗對比實驗組細胞和對照組細胞的差異，結果顯示CD44+CD54+懸浮球細胞具有更強的干細胞特性，是富集度更高的胃癌干樣細胞。接下來，就Lgr5在胃癌干樣細胞中的

5、功能進行了研究。RT-PCR結果提示Lgr5在胃癌干樣細胞的表達量明顯高于普通胃癌細胞。深入研究發(fā)現，將Lgr5干擾慢病毒穩(wěn)定轉染入胃癌干樣細胞后，其懸浮球形成能力、平板克隆能力、增殖能力、抗化療藥能力及裸鼠成瘤能力，較感染前明顯下降。同時檢測β-catenin、Ki67、EphA3和EphrinA5等的mRNA和蛋白的表達，發(fā)現其同Lgr5的變化具有一致性。這些都說明Lgr5-Wnt/β-catenin信號通路在維持胃癌干樣細胞的生物