Lgr5-Wnt-β-catenin信號通路對胃癌干樣細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、近年來，有研究表明作為新的干細(xì)胞標(biāo)記物，Lgr5與Wnt/β-catenin共同組成了重要的信號通路，對腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)活性的調(diào)控也起著重要的作用。然而，有關(guān)該通路與胃癌干細(xì)胞方面的研究，卻罕有報道。前期的相關(guān)研究表明該通路關(guān)鍵蛋白在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)高于普通胃細(xì)胞，Lgr5與胃癌的惡性程度及微血管的密度呈正相關(guān)。因此，Lgr5-Wnt/β-catenin通路是否參與胃癌干樣細(xì)胞的活性調(diào)控，是否通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)維持了胃癌干樣細(xì)胞的惡

2、性生物學(xué)行為仍需進(jìn)一步研究。本實驗擬通過RNAi技術(shù)阻斷該通路，觀察干擾后胃癌干樣細(xì)胞生物學(xué)特性以及相關(guān)靶基因的表達(dá)變化，并利用CCK8、annexinⅤ標(biāo)記、流式細(xì)胞儀等方法綜合分析胃癌干樣細(xì)胞的增殖、凋亡以及血管生成、氧代謝等生物學(xué)行為改變情況。借此尋找一個全新的胃癌干細(xì)胞研究靶點，為今后開展胃癌生物治療奠定基礎(chǔ)。
　　由于胃癌干細(xì)胞缺乏特異性分子標(biāo)記物，因此，確切地說，各個研究所得到的應(yīng)是富集胃癌干細(xì)胞的干樣細(xì)胞。目前CD4

3、4是普遍接受的胃癌干細(xì)胞分子標(biāo)記物，然而，CD44單獨(dú)分選出的胃癌懸浮球細(xì)胞的干性較差，并不具有明顯的優(yōu)勢，因此亟待一個新的分子標(biāo)記物的出現(xiàn)來提高分選所得細(xì)胞的干細(xì)胞特性。CD24、CD133、Tff2等分子雖有一定作用，然而卻缺乏特異性。近來，CD54被認(rèn)為是胃癌干細(xì)胞的分子標(biāo)記物，CD44+CD54+的胃癌細(xì)胞具有更高的成瘤率和增殖能力。這為提高胃癌干樣細(xì)胞的富集度提供了條件。
　　在本研究中，首先進(jìn)行胃癌干樣細(xì)胞提純研究。隨

4、機(jī)選取四種人胃癌細(xì)胞系（AGS、BGC-823、MKN-28、MKN-45）進(jìn)行懸浮球細(xì)胞培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代后使用流式細(xì)胞儀分選出分子標(biāo)記物為CD44+CD54+的實驗組懸浮球細(xì)胞和CD44+CD54-的對照組懸浮球細(xì)胞。并通過懸浮球形成、平板克隆、增殖檢測、抗化療藥物及裸鼠成瘤等實驗對比實驗組細(xì)胞和對照組細(xì)胞的差異，結(jié)果顯示CD44+CD54+懸浮球細(xì)胞具有更強(qiáng)的干細(xì)胞特性，是富集度更高的胃癌干樣細(xì)胞。接下來，就Lgr5在胃癌干樣細(xì)胞中的

5、功能進(jìn)行了研究。RT-PCR結(jié)果提示Lgr5在胃癌干樣細(xì)胞的表達(dá)量明顯高于普通胃癌細(xì)胞。深入研究發(fā)現(xiàn)，將Lgr5干擾慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入胃癌干樣細(xì)胞后，其懸浮球形成能力、平板克隆能力、增殖能力、抗化療藥能力及裸鼠成瘤能力，較感染前明顯下降。同時檢測β-catenin、Ki67、EphA3和EphrinA5等的mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其同Lgr5的變化具有一致性。這些都說明Lgr5-Wnt/β-catenin信號通路在維持胃癌干樣細(xì)胞的生物