microRNA-7調(diào)控胃癌惡性生物學行為的功能與分子機制研究.pdf

1、背景：
　　胃癌是我國乃至世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均位居前列的惡性腫瘤。胃癌的發(fā)生是多種惡性生物學表型相互交織、相互影響、相互促進的序貫過程，其本質(zhì)是細胞中分子事件從穩(wěn)態(tài)走向紊亂的總和。因此，研究胃癌發(fā)生過程中的關鍵分子事件，闡明其中的分子調(diào)控機制，將為胃癌臨床治療提供新的思路和方法。
　　微小 RNA（microRNA，miRNA）是近年發(fā)現(xiàn)的一類在真核細胞中發(fā)揮重要調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼RNA。miRNA通過與蛋白編碼基

2、因mRNA結合，在轉錄后水平抑制基因表達，從而調(diào)控機體的生長發(fā)育和疾病發(fā)生過程。miRNA的調(diào)控特點在于其“一對多”的作用模式，即單個miRNA可通過堿基不完全互補配對方式抑制多個基因表達。此種調(diào)控方式可引起細胞內(nèi)大量分子相互作用關系和信號傳導通路改變，因此，miRNA被認為是調(diào)控細胞生物學行為的關鍵分子之一。
　　microRNA-7（miR-7）于2001年首次在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。2008年以來，miR-7在腫瘤中的作用被陸續(xù)報道

3、，稱其在肝癌、肺癌和乳腺癌中表達降低，發(fā)揮抑癌基因的作用；近年來，亦有報道指出miR-7可促進腎癌的發(fā)生?？梢姡琺iR-7在腫瘤中的功能與機制仍不明確。本實驗室前期通過比對高、低轉移胃癌細胞系的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn) miR-7在高轉移細胞系中表達量顯著降低，提示其可能在胃癌發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。基于文獻報道和前期研究結果，本研究將進一步聚焦miR-7，為闡明其在胃癌惡性生物學行為中發(fā)揮的關鍵功能和調(diào)控機制提供理論和實驗依

4、據(jù)。
　　目的：
　　1.明確miR-7與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關性。
　　2.明確miR-7在調(diào)控胃癌惡性生物學行為中所發(fā)揮的功能。
　　3.揭示miR-7在胃癌中發(fā)揮功能的分子生物學機制。
　　4.揭示miR-7在胃癌中表達失調(diào)的原因。
　　方法：
　　1.利用實時定量PCR方法檢測胃上皮細胞和胃癌細胞、胃癌新鮮組織標本及其匹配的癌旁正常組織中miR-7的表達差異；利用原位雜交（ISH）技術檢測胃

5、癌組織芯片中miR-7的表達水平，并統(tǒng)計分析其與胃癌病理參數(shù)間的相關性。
　　2.合成miR-7的模擬物和抑制物，并構建miR-7的過表達和shRNA干擾載體，分別通過瞬時轉染和穩(wěn)定感染，建立 miR-7的功能獲得與功能缺失細胞模型；分別通過細胞生長曲線、平板集落形成實驗、軟瓊脂集落形成實驗、流式細胞術、Transwell遷移和侵襲實驗、裸鼠移植瘤實驗和裸鼠轉移瘤實驗等方法，研究上、下調(diào) miR-7對胃癌細胞增殖、凋亡和轉移等惡性

6、生物學行為的影響。
　　3.聯(lián)合運用cDNA基因芯片技術和蛋白組學iTRAQ技術，分別在胃癌細胞的轉錄組和蛋白質(zhì)組兩個層次，高通量篩選過表達 miR-7后的差異表達基因，并結合生物信息學方法，篩選差異表達基因中的 miR-7直接作用靶分子；采用雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)，驗證 miR-7與候選靶分子間的相互作用關系；在胃癌細胞中上調(diào)或下調(diào)miR-7后，利用蛋白印跡（Western blot）和實時定量PCR方法分別檢測候選靶分子的表達

7、變化；通過功能實驗和功能挽救實驗，分別驗證 miR-7的靶分子在胃癌惡性生物學行為中所發(fā)揮的功能以及 miR-7通過調(diào)控這一靶分子對胃癌惡性生物學行為的影響。
　　4.通過生物信息學方法，預測miR-7啟動子區(qū)域的轉錄因子結合位點；通過上調(diào)或下調(diào)這一轉錄因子，采用實時定量 PCR方法檢測 miR-7初始轉錄本（primary miR-7，pri-miR-7）的表達變化；利用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗，在胃癌細胞中驗證此轉錄因

8、子與miR-7啟動子的結合情況；在胃癌細胞中上調(diào)或下調(diào)miR-7，分別利用免疫熒光和實時定量PCR方法，檢測miR-7對此轉錄因子表達和定位，以及其下游效應分子表達的影響。
　　結果：
　　1.實時定量PCR結果表明，與正常胃上皮細胞相比，miR-7在胃癌細胞中表達降低，且在高轉移胃癌細胞中表達進一步降低；與癌旁正常組織相比，miR-7在胃癌組織中的表達降低，且在胃癌轉移灶中的表達較原發(fā)灶進一步降低；組織芯片 ISH結果表明

9、，miR-7在大多數(shù)胃癌臨床標本中呈低表達，其表達水平與胃癌分級和分期呈負相關，與胃癌患者生存期呈正相關，并可作為判斷胃癌預后的獨立危險因素。
　　2.實時定量 PCR結果表明，通過轉染和感染 miR-7的模擬物和抑制物，以及miR-7的過表達載體和shRNA干擾載體，能夠有效上、下調(diào)miR-7在胃癌細胞中的表達水平；細胞生長曲線、平板集落形成實驗和軟瓊脂集落形成實驗表明，miR-7能夠抑制胃癌細胞的體外生長過程；通過流式細胞術檢

10、測細胞周期，結果表明miR-7能夠抑制胃癌細胞周期進展；通過流式細胞技術檢測細胞凋亡，結果表明 miR-7能夠促進胃癌細胞早期凋亡；Transwell遷移與侵襲實驗結果表明，miR-7能夠抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力；裸鼠移植瘤實驗結果表明，miR-7能夠抑制胃癌細胞的體內(nèi)生長過程；裸鼠轉移瘤實驗結果表明，miR-7能夠抑制胃癌細胞形成轉移灶的能力。
　　3.在胃癌細胞中瞬時轉染miR-7后，聯(lián)合運用cDNA基因芯片、iTRAQ技

11、術和生物信息學方法，在全基因組的mRNA和蛋白水平高通量篩選出下調(diào)的差異表達基因分別為180個和75個，其中重點關注miR-7對RELA、FOS和IGF1R等與腫瘤增殖和轉移表型密切相關基因的調(diào)控；雙螢光素酶報告基因實驗結果表明，miR-7能夠直接結合RELA、FOS和IGF1R的3’末端非編碼區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）上的結合位點；實時定量PCR和Western blot結果表明，miR-7與RE

12、LA和FOS的mRNA和蛋白表達均呈負相關，但其與IGF1R的負相關關系僅存在于蛋白水平；通過上調(diào)或下調(diào)RELA和FOS的功能實驗結果表明，RELA和FOS能夠促進胃癌細胞增殖，抑制胃癌細胞凋亡；功能挽救實驗結果表明，miR-7能夠通過調(diào)控 RELA和FOS抑制胃癌增殖；進一步機制研究表明，miR-7可通過負向調(diào)控IKKε抑制RELA的激活；通過上調(diào)或下調(diào)IGF1R的功能實驗結果表明，IGF1R能夠促進胃癌細胞侵襲和轉移；功能挽救實驗結

13、果表明，miR-7能夠通過調(diào)控 IGF1R抑制胃癌侵襲和轉移；進一步機制研究表明，miR-7可通過抑制IGF1R，降低Snail的表達，間接促進E-cadherin的表達，抑制胃癌細胞的上皮-間質(zhì)轉化（EMT）過程。
　　4.實時定量 PCR結果表明，在胃上皮細胞中過表達 IKKε和RELA可抑制pri-miR-7的表達，在胃癌細胞系中干擾IKKε和RELA可促進pri-miR-7的表達；通過生物信息學方法，預測到人類基因組中mi

14、R-7的3個編碼基因的啟動子區(qū)域共存在7簇NF-κB的結合位點；ChIP實驗結果表明，RELA能夠與miR-7-1和-2基因的啟動子區(qū)域相結合；免疫熒光結果表明，過表達miR-7可抑制IKKε和RELA的表達，并能夠抑制RELA的核轉位；實時定量PCR結果表明，過表達miR-7可抑制NF-κB信號通路下游多個效應分子的表達；啟動子報告基因和實時定量PCR結果表明，幽門螺桿菌感染能夠上調(diào)NF-κB轉錄活性，并抑制pri-miR-7的表達。

15、
　　結論：
　　本研究明確了miR-7在胃癌細胞和組織中的表達模式，揭示了miR-7表達降低與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關性；明確了miR-7在調(diào)控胃癌惡性生物學行為中所發(fā)揮的功能，表明其在胃癌中起到抑制細胞增殖、促進凋亡和抑制轉移的作用；揭示了miR-7/IKKε/RELA和miR-7/IGF1R/Snail兩條分子通路分別影響胃癌增殖和轉移表型的分子機制；揭示幽門螺桿菌感染導致NF-κB分子通路過度激活對miR-7在胃癌中表達降