人膽囊癌干細胞的分離、鑒定及其惡性生物學行為的調控研究.pdf

1、第一部分體外無血清培養(yǎng)膽囊癌懸浮細胞球及其生物學特性研究
　　 目的：通過體外培養(yǎng)擴增膽囊癌懸浮細胞球并分析其生物學特性，明確其中是否富含有腫瘤干細胞，并初步篩選其細胞表面標志物。
　　 方法：將人原代膽囊癌組織和膽囊癌細胞系GBC-SD 消化制成單細胞懸液，置入含有多種細胞因子的無血清培養(yǎng)液DMEM／F12中培養(yǎng)出腫瘤細胞克隆球；將培養(yǎng)出腫瘤細胞克隆球給予傳代擴增；并將其置入含有血清的分化環(huán)境中貼壁培養(yǎng)，14天后實時定

2、量RT-PCR檢測干細胞標記物Oct-4和Nestin的表達；MTT 法檢測克隆球細胞和貼壁細胞的增殖能力和對化療藥的敏感性，并植入裸鼠皮下比較移植瘤形成能力；用流式細胞術法檢測腫瘤干細胞標志物CD24、CD44、CD133在克隆球細胞和貼壁細胞中的表達。
　　 結果：人原代膽囊癌細胞和GBC-SD細胞均可在干細胞培養(yǎng)環(huán)境中長出克隆球，并可以連續(xù)傳代形成新的克隆球；克隆球細胞在含血清的環(huán)境中出現貼壁生長并分散開，克隆球漸變小最后

3、消失，同時干細胞標記物Oct-4和Nestin的表達下調；與貼壁細胞相比，克隆球細胞在體外具有強的增殖、耐受吉西他濱和5-氟尿嘧啶和在裸鼠皮下形成新的移植瘤能力；經流式細胞術檢測，CD133+細胞在克隆球細胞中的比例高于在貼壁細胞中的比例。
　　 結論：人原代膽囊癌細胞和GBC-SD細胞中存在腫瘤干細胞，可以通過在干細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)得到一定程度的擴增，CD133 蛋白可能為其細胞表面標志物。
　　 第二部分膽囊癌干細胞

4、的分離及生物學特性鑒定
　　 目的：用細胞表面標志物CD24、CD44、CD133分離出膽囊癌亞群細胞并進行腫瘤干細胞特性分析，鑒定出膽囊癌干細胞樣細胞。
　　 方法：將新鮮的人膽囊癌組織標本切成小塊后置入裸鼠皮下建立裸鼠荷瘤模型，為下一步研究提供膽囊癌標本材料；將膽囊癌組織和GBC-SD細胞制成單細胞懸液后，標上抗人CD24-FITC、CD44-APC和CD133-PE 流式抗體，流式細胞術檢測并分離出CD24+、CD

5、44+和CD133+細胞，進一步研究各亞群的生物學特性；將具有腫瘤干細胞特性的亞群標志物聯合檢測、分選亞群細胞及研究生物學特性包括在無血清培養(yǎng)環(huán)境中克隆形成球、對化療藥吉西他濱和5-氟尿嘧啶的敏感性、在NOD/SCID 鼠體內形成異種移植瘤能力及體內自我更新、分化潛能。
　　 結果：新鮮的人膽囊癌組織標本植入裸鼠皮下3～6月后大部分裸鼠成功長出移植瘤；經流式分析CD24+、CD44+和CD133+細胞在原代膽囊癌和GBC-SD細

6、胞中的比例分別為：20.83％~35.72％和55.73％，78.19％~93.36％和96.78％，1.93％~3.43％和61.28％；經生物學特性研究，CD24+和CD24－細胞在形成克隆球、移植瘤形成能力上沒有明顯差別，差異性沒有統(tǒng)計學意義，而CD44+和CD133+細胞在形成克隆球、移植瘤形成能力上均明顯強于相應的陰性亞群；流式進一步檢測觀察到CD44＋CD133＋細胞在原代腫瘤和GBC-SD細胞中的比例為2.53％和 60.

7、62％，且CD44＋CD133＋細胞較CD44＋CD133－細胞具有更強的形成克隆球、耐受化療和移植瘤形成能力；經流式分析和免疫組化檢測CD44＋CD133＋細胞形成的移植瘤細胞中，既有CD44+和CD133+細胞，也含有CD44－和CD133－細胞。
　　 結論：人膽囊癌CD44＋CD133＋細胞具有腫瘤干細胞的特性，其中富集有腫瘤干細胞，CD44和CD133 可用來分離膽囊干細胞。
　　 第三部分 CD133 特異s

8、iRNA 對膽囊癌細胞生物學行為的影響及核轉錄因子Gli在膽囊癌細胞中的表達
　　 目的：通過運用RNAi 干擾技術沉默膽囊癌細胞株GBC-SD的CD133的表達，研究其對GBC-SD細胞的生物學行為的影響，研究核轉錄因子Gli在膽囊癌細胞中的表達。
　　 方法：將CD133 特異性siRNA 轉染膽囊癌細胞株GBC-SD，并運用Western blot和流式細胞術分析并優(yōu)化轉染的效率和效果；在無血清環(huán)境中檢測其克隆球形

9、成能力，運用MTT分析其體外增殖和對5-氟尿嘧啶的耐受性，以細胞劃痕實驗檢測其細胞遷徙能力；運用實時定量RT-PCR檢測核轉錄因子Gli1、Gli2、Gli3在膽囊癌不同亞群中的表達。
　　 結果：特異性siRNA 轉染后，經Western blot和流式細胞術分析，膽囊癌細胞株GBC-SD的CD133表達明顯下調；轉染CD133 特異性siRNA組細胞較空白對照組和轉染非特異性siRNA組細胞，其細胞克隆球形成能力、細胞增殖能