RNAi抑制人膽囊癌VEGF基因表達(dá)及其對膽囊癌細(xì)胞生長與侵襲影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 本實(shí)驗(yàn)的基本思路是：通過構(gòu)建針對人VEGF基因的shRNA干擾質(zhì)粒載體,觀察沉默VEGF基因?qū)δ懩野〨BC-SD細(xì)胞生長和侵襲能力的影響；建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA-VEGF的細(xì)胞株,通過檢測其VEGF受體表達(dá)變化,初步探討VEGF與VEGF受體的相互作用；應(yīng)用膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株分別建立膽囊癌的裸鼠移植瘤模型,觀察各組細(xì)胞的成瘤能力
　　 第一章 shRNA-VEGF質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)

2、建
　　 目的：構(gòu)建針對人膽囊癌VEGF基因的shRNA及其質(zhì)粒表達(dá)載體。
　　 方法：設(shè)計(jì)針對人VEGF基因序列的4組寡核苷酸鏈模板,退火后與載體質(zhì)粒pCY/U6/GFP/Neo連接,然后進(jìn)行酶切鑒定和DNA序列測定。
　　 結(jié)果：酶切鑒定和DNA測序分析后,表明靶向VEGF的RNA干擾質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建針對人VEGF基因的shRNA表達(dá)載體pCY/U6/GFP/Neo-shRNA

3、-VEGF。
　　 第二章 shRNA-VEGF對人膽囊癌細(xì)胞VEGF基因沉默作用及VEGF/VEGFR相互作用的研究
　　 目的：將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膽囊癌細(xì)胞,觀察其對VEGF基因沉默的效果,并采用熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證RNA干擾位點(diǎn)的有效性。篩選出干擾效果最好的質(zhì)粒并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。觀察VEGF受體表達(dá)變化,初步探討VEGF與VEGF受體之間的作用機(jī)制。
　　 方法：①干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膽囊癌GBC-SD細(xì)胞,分別

4、采用半定量PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡方法檢測VEGF mRNA和蛋白表達(dá)情況,篩選出抑制靶基因表達(dá)效果最好的質(zhì)粒；
　　 ②因RNA干擾可能存在“脫靶效應(yīng)”,為驗(yàn)證RNA干擾位點(diǎn)的準(zhǔn)確性,我們設(shè)計(jì)含有VEGF靶位點(diǎn)的引物,將其與熒光素酶報(bào)告基因載體退火連接,再將其與第一部分的干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人膽囊癌細(xì)胞,觀察熒光素酶活性變化,明確RNA干擾位點(diǎn)的有效性；
　　 ③將干擾效率最高的的表達(dá)質(zhì)粒用來建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)

5、胞株。同時(shí)用NC表達(dá)質(zhì)粒作為陰性對照穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。經(jīng)G418篩選,建立兩個(gè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,分別稱為GBC-shV2和GBC-NC；
　　 ④采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的三種VEGF受體的mRNA表達(dá)變化情況,并加入外源性VEGF因子到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中,分別檢測24,48,72小時(shí)VEGF受體的表達(dá)變化情況。初步探討VEGF與其受體之間的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膽囊癌GBC-SD細(xì)胞后,半定量PCR檢測顯示

6、,shVEGF1、shVEGF2、shVEGF3、shVEGF4干擾質(zhì)粒對靶基因mRNA表達(dá)都有抑制作用,其中shVEGF2干擾質(zhì)粒抑制作用最明顯,抑制率達(dá)64％,與空白對照組相比,具有明顯差異實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測顯示,shVEGF1、shVEGF2、shVEGF3干擾質(zhì)粒對靶基因mRNA表達(dá)都有抑制作用,其中shVEGF2干擾質(zhì)粒抑制作用最明顯,抑制率達(dá)83％,與空白對照組相比,具有明顯差異；Western blot方法檢測各組細(xì)胞

7、中VEGF蛋白表達(dá)水平顯示,shVEGF1、shVEGF2干擾質(zhì)粒對靶基因蛋白表達(dá)有抑制作用,其中shVEGF2干擾質(zhì)粒抑制作用最明顯,抑制率達(dá)92％,與空白對照組相比,具有明顯差異?？梢妔hVEGF2干擾質(zhì)粒對VEGF基因表達(dá)抑制最明顯；
　　 ②通過熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)含有VEGF2靶位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因載體被shRNA-VEGF2成功干擾,與對照組比較,熒光素酶活性下降75％,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　

8、③成功建立兩個(gè)分別表達(dá)shRNA-VEGF2和NC質(zhì)粒的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,分別命名為GBC-shV2和GBC-NC細(xì)胞。
　　 ④實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測顯示,相對于陰性穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,GBC-shV2細(xì)胞株中的Flt-1與KDR受體表達(dá)分別下降28％和18％,而NRP-1受體表達(dá)升高47％。我們將外源性VEGF因子加入穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中,檢測Flt-1受體表達(dá)變化：相對于陰性穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,24小時(shí)表達(dá)75％,48小時(shí)表達(dá)183％,72小時(shí)表達(dá)41

9、1％?？梢?外源性VEGF因子加入后,Flt-1受體mNRA的表達(dá)呈明顯上升的趨勢。
　　 結(jié)論：①shRNA-VEGF2干擾質(zhì)?？梢悦黠@抑制人膽囊癌細(xì)胞VEGF基因mRNA和蛋白的表達(dá)；
　　 ②經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明RNA干擾的VEGF基因序列的靶位點(diǎn)是準(zhǔn)確有效的；
　　 ③成功建立穩(wěn)定表達(dá)shRNA-VEGF2質(zhì)粒的細(xì)胞株；
　　 ④人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞存在VEGF的受體;
　　 ⑤

10、膽囊痛細(xì)胞VEGF蛋白可能存在自分泌機(jī)制；
　　 ⑥VEGF可能對其Flt-1受體的表達(dá)有誘導(dǎo)作用。
　　 第三章 shRNA-VEGF對膽囊癌細(xì)胞生長及侵襲能力影響的體外研究
　　 目的：通過對前面試驗(yàn)得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn),探討沉默VEGF基因?qū)θ四懩野〨BC-SD細(xì)胞生長、黏附、遷移運(yùn)動(dòng)及侵襲能力的影響。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)通過腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)以及腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附實(shí)

11、驗(yàn),測定細(xì)胞不同吸光度值,評估膽囊癌細(xì)胞黏附能力變化；通過腫瘤細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn),對比腫瘤細(xì)胞不同的遷移距離,評估膽囊癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力變化；通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)法,計(jì)算穿透膜的細(xì)胞數(shù),評估膽囊癌細(xì)胞侵襲能力變化。
　　 結(jié)果：①從生長曲線看,GBC-shV2細(xì)胞與GBC-SD細(xì)胞相比,增殖生長明顯變慢,細(xì)胞活力下降明顯,達(dá)36％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而GBC-NC細(xì)胞的生長速度和GBC-SD沒有區(qū)別；
　　

12、②與GBC-SD細(xì)胞相比,GBC-shV2細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附率明顯下降,達(dá)55％,與內(nèi)皮細(xì)胞黏附率明顯下降,達(dá)60％,而GBC-NC細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率與GBC-SD細(xì)胞相比沒有明顯區(qū)別；
　　 ③與GBC-SD細(xì)胞相比,GBC-shV2細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)距離明顯減少,達(dá)61％,而GBC-NC細(xì)胞與與GBC-SD細(xì)胞相比沒有明顯區(qū)別；
　　 ④與GBC-SD細(xì)胞相比,GBC-shV2細(xì)胞穿透膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少,

13、減少達(dá)51％,而GBC-NC細(xì)胞與與GBC-SD細(xì)胞相比沒有明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論：shRNA-VEGF干擾質(zhì)粒能抑制膽囊癌細(xì)胞生長,可能使膽囊癌細(xì)胞的黏附,遷移運(yùn)動(dòng)以及侵襲能力降低。
　　 第四章 shRNA-VEGF對膽囊癌增殖及血管形成影響的體內(nèi)研究
　　 目的：應(yīng)用膽囊癌GBC-SD細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株分別建立裸鼠移植瘤模型,觀察其成瘤能力變化；瘤內(nèi)注射重組質(zhì)粒shRNA-VEGF2,觀察對其裸鼠移植瘤VEG

14、F基因表達(dá)的影響以及對腫瘤的生長與血管生成的抑制作用。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)分為裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)與荷瘤裸鼠治療實(shí)驗(yàn)兩部分。
　　 結(jié)果：①裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：GBC-shV2細(xì)胞成瘤時(shí)間在12.7天,成瘤率67％,腫瘤體積抑制率70％。GBC-shV2細(xì)胞組腫瘤組織無明顯出血及壞死,腫瘤與周圍組織粘連較松,易剝離；相對于GBC-SD細(xì)胞組,GBC-shV2組腫瘤組織VEGF蛋白的IOD值下降59％,MVD值下降64％。
　　

15、 ②荷瘤裸鼠治療實(shí)驗(yàn)：與注射培養(yǎng)液組相比較,注射shRNA-VEGF2質(zhì)粒組的腫瘤體積明顯減小,體積抑制率為45％；與A組比較,D組腫瘤組織VEGF的IOD值下降50％,MVD值下降59％。
　　 結(jié)論：針對人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞VEGF基因的RNA干擾技術(shù)可以顯著抑制膽囊癌移植瘤中VEGF基因的表達(dá),可以明顯抑制膽囊癌移植瘤中的新生血管生成,從而間接抑制膽囊癌移植瘤的生長。
　　 第五章 VEGF蛋白的生物信息學(xué)分析

16、
　　 目的：以VEGF-A的生物序列為基礎(chǔ),對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　 方法：首先以Phylip和Treeview軟件繪制該VEGF-A系統(tǒng)進(jìn)化樹；以ExPASY網(wǎng)站提供的生物信息學(xué)分析模塊和分析軟件對VEGF-A的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；預(yù)測VEGF-A的二級結(jié)構(gòu)；使用ExPASy網(wǎng)站上SWISSMODEL模塊進(jìn)行VEGF-A蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測,使用STRING網(wǎng)站上Protein-Protein Interactio

17、ns模塊進(jìn)行VEGF-A蛋白的四級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。
　　 結(jié)果：①從VEGF-A系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出,斑馬魚分支起源最早,然后依次是狗,馬,豬等分支,人VEGF-A的進(jìn)化發(fā)源得比較晚；
　　 ②VEGF-A蛋白所帶總負(fù)電荷殘基數(shù)為2,所帶總正電荷殘基數(shù)為37,VEGF-A的等電點(diǎn)分別是12.38和12.9,這說明VEGF-A是一種帶正電的蛋白質(zhì)。VEGF-A蛋白的親水指數(shù)為-0.605,這說明VEGF-A蛋白是一種疏水性的蛋

18、白質(zhì)。VEGF-A的不穩(wěn)定指數(shù)為31.26,可以看出VEGF是比較穩(wěn)定蛋白；
　　 ③GOR4、HNN、SOPMA三種方法預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)都認(rèn)為第55～60、65～70、98～108位等區(qū)域可能是VEGF-A的功能結(jié)構(gòu)域。分析VEGF-A的親水性、極性以及折返系數(shù)可以發(fā)現(xiàn),第6～12、55～65、132～138、150～157位等區(qū)域可能是VEGF-A的功能結(jié)構(gòu)域。與VEGFA有相互作用聯(lián)系的蛋白質(zhì)有十種,分別是Flt-1,KDR