應用RNA干擾技術抑制膽囊癌survivin基因表達的實驗研究.pdf

1、第一部分 膽囊癌中survivin的表達及其與CD44v6和nm23、VEGF基因表達的關系及其臨床價值 目的探討膽囊癌中survivin、CD44v6和nm23、VEGF基因表達的相關性及其臨床意義。方法采集膽囊癌標本及其病例資料，采用免疫組織化學技術檢測39例膽囊癌標本survivin、CD44v6和nm23、VEGF的表達。統(tǒng)計分析survivin、CD44v6和nm23、VEGF在膽囊癌組織中表達的相關性和sur

2、vivin、CD44v6和nm23、VEGF在膽囊癌表達與病例臨床特征之間的相關性。結果膽囊癌中26例survivin表達陽性，陽性率為66.7％。22例CD44v6表達陽性，陽性率為56.4％。15例nm23表達陽性，陽性率為38.5％。膽囊癌組織survivin與CD44v6的表達陽性率高于癌旁組織及膽囊腺瘤性息肉組織組織(P＜0.05)。CD44v6、nm23的表達與膽囊癌腫瘤轉移相關(P＜0.05)。相關性檢驗示survivin

3、、CD44v6和nm23之間有相關性。24例VEGF表達陽性，陽性率為61.5％。膽囊癌組織survivin與VEGF的表達陽性率高于癌旁組織及膽囊腺瘤性息肉組織組織(P＜0.05)。VEGF的表達與膽囊癌腫瘤轉移顯著相關(P＜0.01)。相關性檢驗示survivin與VEGF之間有相關性(x2=4.388，P＜0.05)。結論survivin在膽囊癌中的表達能促進膽囊癌的發(fā)生發(fā)展。膽囊癌中survivin、CD44v6和VEGF蛋白表

4、達均上調(diào)，共同參與膽囊癌發(fā)生和發(fā)展，CD44v6、VEGF與survivin、nm23有協(xié)同表達關系。 第二部分 膽囊癌GBC-SD細胞經(jīng)順鉑處理survivin的表達及意義 目的探討經(jīng)順鉑(DDP)處理膽囊癌細胞后survivin表達及其與腫瘤細胞耐藥之間的關系。方法采用MTT比色法測定膽囊癌細胞對4種化療藥物的敏感性。RT-PCR檢測survivinmRNA的表達。Westernblot檢測survivin蛋

5、白表達的變化。結果GBC-SD細胞對化療藥物的敏感性從高到低依次為DDP＞ADM＞5-FU＞MMC?；瘜W藥物處理后的第1天，3組膽囊癌細胞的survivinmRNA表達水平均降低；其中0.5μg/mlDDP+GBC-SD組下降了10％，3μg/mlDDP+GBC-SD組下降36％，6μg/mlDDP+GBC-SD組下降了28％。第3天，0.5μg/mlDDP組和3μg/mlDDP組GBC-SD細胞的survivinmRNA表達與第1天比

6、較，分別上升22％和64％，但6μg/mlDDP組仍持續(xù)降低，僅為第1天的66％。0.5μg/mlDDP組和3μg/mlDDP組作用3天后的GBC-SD細胞中survivin蛋白含量分別升高了15％和12％，而6μg/mlDDP組則下降了80％。結論低濃度的DDP即能誘導膽囊癌細胞內(nèi)survivin的表達增加，這可能是膽囊癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性的因素之一。 第三部分 survivinshRNA表達質(zhì)粒的構建、轉染和篩

7、選 目的構建針對survivin基因的短發(fā)夾環(huán)RNA(shRNA)的真核表達載體，并篩選出穩(wěn)定表達survivinshRNA的GBC-SD細胞。方法設計、合成包含BbsI酶切位點的針對survivin的shRNA，與BbsI酶切后真核表達載體pEGFP-H1連接，將其定向克隆至H1啟動子下，構建成重組載體pEGFP-survivin；采用脂質(zhì)體法將pEGFP-H1和重組質(zhì)粒導入到GBC-SD細胞中，用流式細胞儀檢測轉染效率；用G

8、418對轉染的細胞進行穩(wěn)定篩選。結果酶切分析和測序證實pEGFP-survivin構建成功；pEGFP-H1與pEGFP-survivin在GBC-SD細胞中的轉染效率分別為(80.29±2.71)％和(83.85±2.34)％(P＞0.05)。通過G418篩選獲得了穩(wěn)定表達的GBC-SD細胞株，分別命名為GBC-SD/EGFP和GBC-SD/survivin。結論成功構建了針對survivin基因的shRNA真核表達載體，并獲得了穩(wěn)定

9、表達survivinshRNA的細胞株GBC-SD/survivin。 第四部分 pEGFP-survivin對GBC-SD細胞生長的抑制及對化療敏感性的影響 目的觀察pEGFP-survivin對GBC-SD細胞化療敏感性的影響。方法以MTT法檢測GBC-SD、GBC-SD/EGFP和GBC-SD/survivin三種細胞的增殖活性；用RT-PCR和WesternBlot測各組細胞中survivinmRNA和蛋

10、白質(zhì)水平的表達；以合適濃度的DDP作用相同的時間后，用MTT法檢測三種細胞存活率，流式細胞儀測細胞凋亡，并用MTT法篩選IC50值，TUNEL法觀察細胞核改變；另外檢測DDP作用后各組細胞的caspase-3蛋白酶活性的變化。結果GBC-SD和GBC-SD/EGFP細胞的增殖活性大致相同，而GBC-SD/survivin細胞的增殖活性則明顯下降；RT-PCR和WesternBlot均發(fā)現(xiàn)GBC-SD/survivin細胞中的surviv

11、in表達水平較其余兩種細胞明顯下降；在給與了DDP作用后，GBC-SD/survivin細胞存活率和IC50明顯較低，細胞凋亡率較高，而三種細胞用TUNEL法染色后均可見棕色凋亡細胞核。給與了DDP作用后，各組細胞Caspase-3活性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，但GBC-SD/survivin細胞中Caspase-3的活性明顯高于另外兩種細胞。結論pEGFP-survivin表達的survivinshRNA能明顯降低GBC-SD細胞中s