靶向Survivin基因RNA干擾抑制人腺樣囊性癌細胞生長的實驗研究.pdf

1、目的： 涎腺腺樣囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcinoma,SACC)，是一種涎腺惡性腫瘤。其特點是惡性程度高，侵襲性強，易復發(fā)、易早期轉移，且對放療、化療不敏感，手術治療難以根除。因此，尋求有效的輔助性治療手段非常必要。腫瘤基因治療已成為最引人矚目的研究領域，是繼手術、放療、化療之后的又一種治療模式。本研究采用RNA干擾技術阻斷凋亡抑制因子Survivin在腺樣囊性癌細胞中的表達，觀察其對于ACC細胞

2、生物學行為的影響，并對其作用機制作初步探討。 方法： 本實驗針對SurvivinmRNA設計和構建特異性的siRNA重組干擾質(zhì)粒；采用脂質(zhì)體介導法轉染人腺樣囊性癌細胞株ACC-2，以WesternBlot和RT-PCR法檢測SurvivinsiRNA對ACC-2細胞Survivin和Caspase-3表達的變化；并應用MTT法檢測穩(wěn)定轉染的ACC-2細胞株增殖的變化；采用透射電鏡技術、TUNEL，法和流式細胞技術檢測細胞

3、凋亡，觀察細胞超微結構改變以及細胞周期的變化。 結果： 1、經(jīng)上海生工生物工程技術有限公司測序，成功獲得重組克隆測序結果，結果表明，成功構建靶點特異性的SurvivinsiRNA重組質(zhì)粒。 2、以DOTAP脂質(zhì)體介導法將SurvivinsiRNA轉染人腺樣囊性癌細胞株ACC-2。在熒光顯微鏡下觀察細胞，成功轉染的細胞通常因為共同表達的綠色熒光蛋白從而發(fā)綠色熒光。經(jīng)過G418的篩選后，獲得穩(wěn)定轉染siSurvivi

4、n質(zhì)粒的ACC-2細胞克隆。 3、細胞內(nèi)Survivin蛋白及mRNA表達相對水平是非處理組的35％和27％；Survivin表達顯著降低。 4、細胞內(nèi)Caspase-3蛋白及mRNA表達相對水平是非處理組的189％和134％，Caspase-3表達明顯增多。 5、MTT實驗提示：隨著培養(yǎng)時間的延長，Survivin基因沉默組的OD值較對照組明顯降低，細胞增殖明顯受抑制。 6、透射電鏡觀察可見Surviv

5、in基因沉默組ACC細胞超微結構呈凋亡樣改變，出現(xiàn)線粒體腫脹及細胞漿濃縮特征性表現(xiàn)。 7、TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)Survivin基因沉默組呈棕黃色染色的凋亡細胞較對照組有明顯增多。 8、流式細胞儀檢測細胞周期，細胞在G1期比例明顯增多，而在G2/M期有所減少。 結論： 1、siRNA重組干擾質(zhì)粒轉染能夠高效地抑制ACC-2細胞株SurvivinmRNA和蛋白的表達，并成功篩選出最有效沉默Survivin表達的