RNA干擾技術(shù)對食管癌細胞Survivin基因表達的抑制作用及其促凋亡研究.pdf

1、第一部分:食管癌組織中survivin蛋白的表達及其臨床意義
　　目的: Survivin基因與腫瘤的發(fā)生、生長和侵襲有關(guān),但其在食管癌發(fā)病機理中的作用尚未明確。本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測食管癌組織中survivin蛋白的表達,確定survivin基因在人食管癌組織中的表達水平,并探討其臨床意義。
　　方法:以汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理檢驗科05年9月至12月的38例食管癌患者手術(shù)切除標本為材料,其中男性31例,女性7例。年齡4

2、1-78歲,中位年齡58歲。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測survivin蛋白的表達,對結(jié)果行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:38例食管鱗癌中,survivin陽性24例,表達率為63.16％(24/38);遠端正常對照組未見survivin陽性表達。Survivin陽性表達與年齡、腫瘤分化程度相關(guān);但與性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論:Survivin蛋白在食管癌組織表達上調(diào);Survivin基因可能成為食管癌基因治療的靶點。<

3、br>　　第二部分:RNA干擾表達載體抑EC-109細胞Survivin基因表達的體外研究
　　目的:構(gòu)建針對Survivin基因的RNA干擾表達載體,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNAi)研究針對Survivin基因的siRNA,抑制Survivin基因表達并誘導(dǎo)食管癌細胞系EC-109細胞的凋亡。
　　方法:EC-109細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)。利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建針對Survivin的siRNA表達質(zhì)粒pSIREN/S,及對照質(zhì)粒pS

4、IREN/CN。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至EC-109細胞,熒光顯微鏡判斷轉(zhuǎn)染效率。蛋白印跡和半定量RT-PCR檢測Survivin蛋白表達及基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,免疫熒光技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSIREN/S后Survivin基因在EC-109細胞的表達情況。在不同時間點收集轉(zhuǎn)染細胞,提取細胞基因組DNA,電泳檢查DNA ladder的形成;利用流式細胞術(shù)觀察siRNA抑制Survivin基因表達后誘導(dǎo)細胞凋亡的情況。
　　結(jié)果:熒光顯微鏡結(jié)

5、果顯示,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率達46.7%。半定量RT-PCR檢測到pSIREN/S質(zhì)粒在EC-109細胞內(nèi)對Survivin基因的轉(zhuǎn)錄抑制率為74.04%;蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSIREN/S的EC-109細胞Survivin蛋白表達量僅為正常組的41.64%,而對照質(zhì)粒pSIREN/CN對Survivin基因的蛋白表達及轉(zhuǎn)錄均沒有抑制作用。利用RNA干擾技術(shù)抑制survivin的表達,EC-109細胞的基因組DNA出現(xiàn)明顯的D