Survivin基因RNAi真核表達(dá)載體對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、目的:白血病是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤,細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡失衡是其發(fā)生的主要原因之一.Survivin是細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族(Inhibtor of Apoptosis Family ofProteins,IAPs)新成員之一,其表達(dá)具有高度特異性,在正常成年組織不表達(dá)而在多種腫瘤中高表達(dá),而且survivin的表達(dá)與腫瘤的惡性程度及患者的預(yù)后密切相關(guān)<'[1,2]>.RNA干擾(RNA interference,RNAi)是雙鏈RNA(do

2、uble-strandedRNA,dsRNA)分子在mRNA水平封閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)使其沉默的過(guò)程,是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS).RNAi是生物體抵抗病毒入侵、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制.RNAi介導(dǎo)的基因沉默已經(jīng)成為一種快速有效地研究基因功能和基因治療的手段.本實(shí)驗(yàn)利用轉(zhuǎn)錄載體pSINsi-Hu6構(gòu)建靶向survivin基因的短發(fā)夾狀RaNA(short hairpin RNA,shRNA)的真核表達(dá)載體,研究其在白血病

3、細(xì)胞株HL-60中對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響,為進(jìn)一步研究沉寂survivin基因用于白血病細(xì)胞的基因治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù). 方法: 1.構(gòu)建針對(duì)survivin基因的shRNA真核表達(dá)載體,即pSIN/shRNA. 2.實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染組,陰性對(duì)照組,空白對(duì)照組; 3.采用RT-PCR法檢測(cè)pSIN/shRNA對(duì)HL-60細(xì)胞對(duì)survivin mRNA表達(dá)的影響;免疫組化法檢測(cè)pSIN/shRNA對(duì)H

4、L-60細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)的影響. 4.采用四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTI法)檢測(cè)pSIN/shRNA轉(zhuǎn)染HL-60增殖情況. 5.應(yīng)用流式細(xì)胞儀Annexin v-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡. 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),采用單因素方差分析(ANOVA.),以a=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn).結(jié)果:1.重組質(zhì)粒的酶切及測(cè)序鑒定:用限制性內(nèi)切酶Ba

5、mH I、Cla I雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳顯示:重組載體可產(chǎn)生5606bp和63bp的片斷,而空載體產(chǎn)生6522bp的DNA片斷.重組質(zhì)粒經(jīng)自動(dòng)基因測(cè)序儀測(cè)序(上海申能博彩生物公司),結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全相符,所含目的基因序列準(zhǔn)確無(wú)誤,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.2.pSIN/shRNA對(duì):HL-60細(xì)胞survivin mRNA及Survivin蛋白表達(dá)的影響:RT-PCR.結(jié)果顯示:4.Oμg pSIN/shRNA轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞24、48

6、、72、96h后,轉(zhuǎn)染各時(shí)間組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,對(duì)目的基因mRNA表達(dá)水平下調(diào)有顯著性差異(P<0.01),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間無(wú)顯著性差異(P>0.05).轉(zhuǎn)染各時(shí)間組組間比較,轉(zhuǎn)染24h組對(duì)目的基因mRNA表達(dá)下調(diào)水平明顯低于48、72、96h組,有顯著性差異(P>0.05).48h、72h、96h間無(wú)顯著性差異(P>0.05).免疫組化結(jié)果顯示:4.0μg pSIN/shRNA作用HL-60細(xì)胞48h后,空白對(duì)照組

7、與陰性對(duì)照組Survivin蛋白HL-60細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性積分為(147.32±13.71)和(142.33±14.43),轉(zhuǎn)染組Survivin蛋白表達(dá)明顯降低,積分為(50.33±7.33).兩對(duì)照組間積分均顯著高于轉(zhuǎn)染組,與轉(zhuǎn)染組相比有顯著性差異(P<0.01),兩對(duì)照組間積分無(wú)明顯差異(P>0.05).3.pSIN/shRNA對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示:4.0μg pSIN/shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,每24小時(shí)

8、檢測(cè)各組細(xì)胞,連續(xù)檢測(cè)72小時(shí),觀察pSIN/shRNA對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用,24h開(kāi)始出現(xiàn)抑制作用,48h抑制作用最強(qiáng),轉(zhuǎn)染各時(shí)間組與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較,對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間無(wú)差異(P>0.05).轉(zhuǎn)染各時(shí)間組組間比較,24h組與48、72h組間比較對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),48、72h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0

9、.05).本實(shí)驗(yàn)表明,pSIN/shRNA對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用有時(shí)間依賴性和序列特異性,其作用最佳時(shí)間為48h.4.pSIN/shRNA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的作用:轉(zhuǎn)染4.0μg pSIN/shRNA 48h后,pSIN/shRNA組胞凋率可達(dá)(20.21±O.75)﹪,明顯高于陰性對(duì)照組的(2.58±0.48)﹪和空白對(duì)照組的(1.26±0.30)﹪,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(P<0.01).陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義