拓?fù)涮婵祵L-60細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用.pdf

1、目的：DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ，TopoⅠ)，是生物體內(nèi)極其重要的細(xì)胞核內(nèi)酶，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等關(guān)鍵的過程。拓?fù)涮婵?topotecan，TPT)是一種新的水溶性、半合成喜樹堿(Camptothecin，CPT)衍生物，它以TopoⅠ為靶點(diǎn)，通過與Topo-Ⅰ和DNA形成三重復(fù)合物，阻止DNA轉(zhuǎn)錄及復(fù)制等過程，發(fā)揮其獨(dú)特的抗癌作用。TPT作為新一代的TopoⅠ抑制劑，目前已被廣泛試用于血液系統(tǒng)惡性

2、疾病的治療。原癌基因c-myc是myc家族的重要成員，其編碼的磷酸化蛋白質(zhì)屬核蛋白類，對正常細(xì)胞的增殖、分化、凋亡起重要作用。研究表明c-myc在HL-60細(xì)胞株和白血病病人的白血病細(xì)胞中均高表達(dá)，可能與白血病的發(fā)生、病程演變及預(yù)后等密切相關(guān)。有資料顯示抑制c-myc基因的表達(dá)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。雖然TPT在治療白血病等惡性血液病的臨床實(shí)驗(yàn)中已顯示了明顯的抗腫瘤活性，但對其作用的分子機(jī)理尚不清楚，TPT對白血病細(xì)胞的作用及

3、其與c-myc之間的關(guān)系有待探討。本實(shí)驗(yàn)旨在研究TPT誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用及TPT抑制內(nèi)源性c-mycmRNA及其蛋白的表達(dá)效果，為進(jìn)一步了解TPT對腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，提高TPT的臨床療效提供有意義的實(shí)驗(yàn)資料。 材料與方法：1.白血病細(xì)胞系HL-60由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室提供。 2.采用四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTT法)檢測0.05、0.10、0.15、0.20μmol/L的TPT分別作用于HL-60細(xì)胞后4h

4、、8h、12h、16h的增殖情況，計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率，并找出TPT作用HL-60細(xì)胞的最適時(shí)間和最適濃度。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。 3.采用流式細(xì)胞儀技術(shù)(AnnexinVFITC分析法)檢測細(xì)胞凋亡率；原位酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL技術(shù))檢測細(xì)胞的凋亡情況。 4.采用RT-PCR方法檢測TPT對HL-60細(xì)胞c-mycmRNA表達(dá)的影響；用免疫組化方法檢測TPT對HL-60細(xì)胞C-myc蛋白表達(dá)的影響

5、。 5.所得結(jié)果應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本的T檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。兩樣本率的比較采用四格表資料的x2檢驗(yàn)。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果：1.藥物對HL60細(xì)胞增殖的抑制作用采用MTT比色法檢測結(jié)果顯示：同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度的TPT(0.05、0.10、0.15、0.20μmol/L)對HL-60細(xì)胞的抑制作用，與空

6、白對照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；0.20μmol/L與0.15μmol/L的藥物對HL-60細(xì)胞生長的抑制作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。同一濃度TPT在不同時(shí)間點(diǎn)(4h、8h、12h、16h)對HL-60細(xì)胞的抑制作用與對照組相比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TPT作用HL-60細(xì)胞16h與12h的抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。總的來說TPT抑制HL-60細(xì)胞生長具有劑量和時(shí)間的依賴性，其作用的最適濃度為0

7、.15μmol/L，最適時(shí)間為12h。 2.TPT對HL-60細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用流式細(xì)胞儀技術(shù)(AnnexinVFITC分析法)研究了磷脂酰絲氨酸(PS)轉(zhuǎn)位，結(jié)果顯示：0.15μmol/LTPT作用于HL-60細(xì)胞4h，細(xì)胞凋亡率為(28.57±3.16)％與空白對照組比(3.12±0.38)％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TUNEL結(jié)果顯示：采用0.15μmol/LTPT作用HL-60細(xì)胞12h后，檢測陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)

8、算陽性表達(dá)率發(fā)現(xiàn)，TPT對HL-60細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，與空白對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(38.33％對2.67％，P＜0.05)。 3.TPT對HL-60細(xì)胞c-myc基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示：0.15μmol/LTPT作用于HL-60細(xì)胞12h后，c-mycmRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)至(0.17±0.03)，與空白對照組相對表達(dá)量相比較(1.11±0.25)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。