藏紅花素對HL-60細胞增殖抑制的影響及其機制的研究.pdf

1、目的：本研究探討藏紅花素(crocin)對人急性白血病細胞HL-60增殖抑制的影響及其促凋亡機制。
　　 方法：無菌條件下配制crocin溶液，實驗分為A-F六組，crocin終濃度分別為0、0.625、1.25、2.5、5.0和10mg/ml。采用血細胞計數(shù)板人工計數(shù)法測定HL-60細胞在不同濃度crocin作用后的生長曲線，利用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)混合染液染色，在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡

2、細胞，計算凋亡率。MTT法檢測細胞的增殖情況，計算不同濃度crocin作用于HL-60細胞不同時間的抑制率。流式細胞儀檢測crocin作用48h后HL-60細胞周期分布，RT-PCR檢測crocin作用24、48h后bcl-2,bax基因的表達。
　　 結(jié)果：
　　 ①細胞生長曲線的測定結(jié)果顯示，當Crocin濃度為0.625-10mg/ml，體外可抑制HL-60細胞的增殖，隨著藥物濃度的升高，作用時間的延長，HL-60

3、細胞數(shù)目逐漸減少，呈現(xiàn)出抑制作用，以10mg/ml濃度作用48h時抑制作用最明顯。MTT法結(jié)果顯示，crocin作用24h時，隨著藥物濃度的升高，抑制率逐漸升高，組間比較差異有顯著性(F=2.84，P<0.05)，以10mg/ml濃度時抑制率最高。crocin作用48h時，隨著藥物濃度的升高，實驗各組細胞抑制率逐漸升高，組間比較差異有顯著性(F=4.71，P<0.05)。當crocin濃度為10mg/ml時，作用48h與24h時相比，差

4、異有顯著性(t=3.59，P<0.05)。
　　 ②熒光顯微鏡下對細胞觀察結(jié)果顯示，crocin作用24h后，對照組中偶見凋亡細胞，在0.625-5mg/ml時，隨著藥物濃度的增加，凋亡細胞數(shù)目明顯增多，以5mg/ml濃度凋亡細胞形態(tài)最為明顯．10mg/ml濃度組，凋亡細胞少見，可見大量壞死及崩解的細胞。作用48h時，以5mg/ml濃度組凋亡細胞數(shù)目明顯增多，且隨著作用時間延長，晚期凋亡細胞增多。在0.625-5mg/ml范圍內(nèi)

5、，HL-60細胞凋亡率逐漸升高，濃度為10mg/ml時凋亡率反而下降，藥物濃度過高表現(xiàn)出壞死作用。
　　 ③流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示，crocin作用于HL-60細胞48h后，在0-5mg/ml濃度范圍內(nèi)，G0/G1期細胞數(shù)比例組間比例差異有顯著(F=185，P<0.05)，組內(nèi)兩兩比較差異仍有顯著性(P<0.05)。在0.625-5mg/ml藥物范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的升高，G0/G1期細胞數(shù)比例逐漸升高，以濃度為5mg/

6、ml時G0/G1期細胞數(shù)比例最高，與實驗各組比較差異有顯著性（P均<0.01）。濃度為10mg/ml時，G0/G1期細胞數(shù)比例反而下降，與濃度為5mg/ml時比較差異有顯著性(P<0.05)，與A-D各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）
　　 ④RT-PCR檢測結(jié)果顯示，作用時間分別為24h、48h時，隨crocin作用濃度的升高，bcp-2基因條帶亮度逐漸減弱?；叶葤呙璞戎到Y(jié)果顯示：在0-10mg/ml藥物范圍內(nèi)，組間比

7、較差異有顯著性(P<0.05)，組內(nèi)兩兩比較，A組與B組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨藥物濃度升高，bcl-2基因表達逐漸減少，以10mg/ml表達最弱。
　　 作用時間分別為24h、48h時，隨crocin作用濃度的升高，bax基因條帶亮度逐漸增強?；叶葤呙璞戎到Y(jié)果顯示：在0-10mg/ml藥物范圍內(nèi)，組間比較差異有顯著性(P<0.05)，組內(nèi)兩兩比較，A組與B組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨藥物濃度升高，bax基

8、因表達逐漸增強，以10mg/ml表達最強．
　　 結(jié)論：
　　 1、通過不同濃度crocin作用，HL-60細胞生長明顯受抑制，并呈現(xiàn)出劑量時間依賴關(guān)系。在0.625-5mg/ml范圍內(nèi)，HL-60細胞凋亡率逐漸升高。當crocin濃度10mg/ml時，HL-60細胞凋亡率并沒有升高，反而下降，表現(xiàn)為細胞壞死。
　　 2、Crocin對HL-60細胞周期起阻滯作用，被阻滯于G0/G1，且在5mg/ml時阻滯作用最

9、明顯。濃度為10mg/ml時，G0/G1期細胞數(shù)比例反而下降，藥物濃度過高時，對HL-60細胞主要表現(xiàn)為細胞毒性作用。
　　 3．Crocin抑制Bcl-2基因表達，在1.25-10mg/ml范圍內(nèi)均表現(xiàn)出抑制作用，在濃度為10mg/ml作用-48h時抑制作用最強。Crocin促進Bax基因的表達，在1.25-10mg/ml范圍內(nèi)均表現(xiàn)出促進作用，在濃度為10mg/ml作用48h時促進作用最強。
　　 4、Crocin可