異常黑膽質(zhì)成熟劑活性組分及其抑制HL-60細(xì)胞增殖作用的研究.pdf

1、目的：異常黑膽質(zhì)成熟劑（國家發(fā)明專利№：C082130082.8）是維吾爾醫(yī)復(fù)方制劑，由破布木（Cordia dichotoma Forst.）、紅棗（Ziziphus jujuba Mill.）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、牛舌草（Anchusa italica Retz.）、小茴香（Foeniculum vulgare Mill.）、地錦草（Euphorbia humifusa Willd.）等

2、藥材組成，用于治療由異常黑膽質(zhì)所導(dǎo)致的腫瘤、糖尿病和心血管疾病等?，F(xiàn)代研究已證實，異常黑膽質(zhì)成熟劑可清除自由基、保護(hù)羥自由基引發(fā)的DNA氧化損傷和線粒體氧化損傷等，具有較強的抑制HepG2細(xì)胞體外生長、抑制HepG2細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)生物合成等作用。
　　 本文目的在于研究異常黑膽質(zhì)成熟劑的化學(xué)組分并測定主要組分含量，以評價異常黑膽質(zhì)成熟劑的物質(zhì)組成；進(jìn)一步確定異常黑膽質(zhì)成熟劑的體外抗癌有效部位；以及評價復(fù)方中各單味藥體

3、外抗癌作用；研究適于工業(yè)化生產(chǎn)的異常黑膽質(zhì)成熟劑不同提取物的制備方法；建立異常黑膽質(zhì)成熟劑有效部位色譜分析方法并評價異常黑膽質(zhì)成熟劑有效部位的主要化學(xué)成分。
　　 方法：
　　 1．通過對異常黑膽質(zhì)成熟劑化學(xué)成分的系統(tǒng)預(yù)試，初步確定異常黑膽質(zhì)成熟劑所含化學(xué)成分的種類；以蘆丁為對照品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法測定總黃酮含量；以沒食子酸為對照品，采用Folin-Ciocalteu比色法測定總酚含量；以

4、葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量；以甘草酸銨為對照品，采用香草醛-高氯酸法測定總皂苷含量；采用重量法測定總生物堿含量。
　　 2．從異常黑膽質(zhì)成熟劑中提取四種提取物即Extr-1、Extr-2、Extr-3和Extr-4。其中Extr-1、Extr-2和Extr-3三種提取物的制備采用大孔吸附樹脂法，Extr-4的制備采用聚酰胺法；用TLC以及化學(xué)成分單項預(yù)試等方法對四種提取物所含成分進(jìn)行初步研究；測定其主要化學(xué)組分

5、的含量并對這四種提取物對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用進(jìn)行對比研究；測定Extr-4對HL-60細(xì)胞的IC50值；以Silicagel 60 F254為固定相，分別以固藍(lán)B鹽試劑（FBS）和茴香醛/硫酸試劑（AS）為顯色劑，對異常黑膽質(zhì)成熟劑的不同提取物進(jìn)行TLC分析。
　　 3．采用固相萃取法（Solid phase extraction，SPE）對Extr-4進(jìn)行組分分離。具體操作為：SPE小柱以MeOH和水淋洗后備用。Ext

6、r-4溶解于40%MeOH后裝于SPE小柱內(nèi)，將樣品減壓抽干，所得流出液減壓濃縮并干燥，作為第一組分，即SPE-p（未被SPE柱吸附的成分）。SPE小柱依次用0%、20%、40%、60%和80%MeOH進(jìn)行梯度洗脫，所得洗脫液分別減壓蒸發(fā)至干，即得SPE-0、SPE-20、SPE-40、SPE-60和SPE-80等干燥備用的五個組分。將HL-60細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，其細(xì)胞濃度為0.1×106個/ml，分為7組，培養(yǎng)24h后第一組加入供試

7、品溶劑，作為空白對照組，其余6組分別加入SPE-0、SPE-20、SPE-40、SPE-60和SPE-80待測溶液，樣品在細(xì)胞培養(yǎng)基中最終濃度均為50μg/ml，將培養(yǎng)板置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫孵箱中培養(yǎng)，于24h、48h和72h用臺盼藍(lán)染色法檢測各組細(xì)胞存活率。為了確保實驗結(jié)果的正確無誤，重復(fù)進(jìn)行兩次試驗。
　　 4．運用ASE技術(shù)分別對組成異常黑膽質(zhì)成熟劑的中各單味藥進(jìn)行提取。具體操作為：將各單味藥粉碎成粉末，

8、置于底部提前加入濾膜且已知重量的萃取池中，稱重，關(guān)閉萃取池蓋后將其固定在圓盤式傳送裝置上，依次以CH2Cl2和MeOH為提取溶劑，設(shè)定ASE提取方法參數(shù)，啟動加速溶劑提取儀進(jìn)行提取，提取完成后儀器自動停止，將提取液轉(zhuǎn)移至已知重量的50ml圓底燒瓶中，于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成濃浸膏，以空氣流吹干，稱重，即得各單味藥（除刺糖外）的CH2Cl2和MeOH提取物。取HL-60細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為0.1×106個/ml，分為19組，每

9、組設(shè)3個平行孔，培養(yǎng)24h后第一組加入96% EtOH 10.05 μl，作為空白對照組、其余18個組依次加入九味藥的CH2Cl2提取物和MeOH提取物的待測溶液各10.05μl，以使其在細(xì)胞培養(yǎng)基中的最終濃度各為100 μg/ml，將培養(yǎng)板置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫孵箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率，并在顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。以Silicagel 60 F254為固定相，分別以固藍(lán)B鹽

10、試劑和天然產(chǎn)物/聚乙二醇試劑為顯色劑，對異常黑膽質(zhì)成熟劑的不同提取物及各單味藥進(jìn)行TLC分析。
　　 5．對Extr-4和各SPE組分所含酚類化合物進(jìn)行HPLC分析。色譜條件如下：色譜柱為Hypersil BDS-C18 柱（4.0mm×250mm，5μm），美國安捷倫；保護(hù)柱為LiChospher? 100 RP-18（4.0 mm×4.0mm，5μm），德國惠普。檢測波長為254nm，并在190～450nm范圍內(nèi)對樣品進(jìn)行紫

11、外波長掃描。流動相由A（水-冰醋酸，Ph2.8）和B（乙腈-冰醋酸，其中冰醋酸用量與A相等）組成，用前新鮮配制并超聲脫氣。樣品梯度洗脫條件：0～60min，流動相B由15%線性遞增至50%；60～70min，流動相B由50%線性遞增至99%；70～75min，流動相B保持99%；75～76min，流動相B由99%線性遞減至15%。流速：1.2ml/min，柱壓：140～172巴。柱溫：室溫，進(jìn)樣量：10μl。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品、供試品和含標(biāo)準(zhǔn)品

12、的供試品三者色譜圖中相應(yīng)色譜峰的保留時間和紫外光譜，對Extr-4和各SPE組分所含酚類化合物進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 1．異常黑膽質(zhì)成熟劑化學(xué)成分的系統(tǒng)預(yù)試結(jié)果表明異常黑膽質(zhì)成熟劑含糖、皂苷、酚、黃酮、生物堿、香豆素和/或內(nèi)酯、有機(jī)酸和氨基酸等成分，但鞣質(zhì)、花青素、蒽醌和強心苷等化合物的預(yù)試結(jié)果呈陰性。測定了異常黑膽質(zhì)成熟劑中總黃酮、總酚、總糖、總皂苷和總生物堿含量。結(jié)果，蘆丁濃度在0.011～0.130mg/m

13、l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限（LOD）為0.06μg/ml，定量限（LOQ）為0.18μg/ml。該方法加樣回收率為95.1%～97.5%，精密度為1.34%，水提物和醇提物中總黃酮含量分別為1.62%和1.96%；沒食子酸濃度在1.1～7.7μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LOD為0.01μg/ml，LOQ為0.03μg/ml。該方法加樣回收率為99.5%～104.8%，精密度為3.39%，水提物和醇提物中總酚含量分別為3.83%和2.

14、15%；葡萄糖濃度在0.0023～0.0146mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法加樣回收率為97.5%（n=9），精密度為1.86%（n=5），供試品總糖含量為57.99±1.36%（n=3）；甘草酸銨濃度在0.0115-0.0577mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。該方法加樣回收率為90.4%（n=5），精密度為1.14%（n=5），供試品總皂苷含量為4.69±0.08%（n=3）；異常黑膽質(zhì)成熟劑總生物堿含量至多不超過0.44%。

15、>　　 2．TLC以及化學(xué)成分單項預(yù)試結(jié)果提示Extr-1，Extr-3和Extr-4分別含糖、皂苷和酚類化合物，從Extr-2中也可檢出皂苷和酚類化合物，但其皂苷類化合物的色譜斑點不如Extr-3明顯，其酚類化合物的色譜斑點不如Extr-4明顯。與Extr-1、Extr-2和Extr-3相比，Extr-4中屬于酚類化合物斑點的顏色明顯比Extr-2和Extr-3深，其酚類化合物斑點的數(shù)量也比Extr-2和Extr-3多。對Extr-

16、1、Extr-3和Extr-4三種提取物主組分的定量實驗結(jié)果顯示，Extr-1總糖含量為51.4%±0.9%；Extr-3總皂苷含量為60.7%±0.1%；Extr-4總酚和總黃酮含量分別為33.3%±0.7%和13.9%±0.7%。由于Extr-2從未能檢出特征性化學(xué)組分，故未對其化學(xué)組分進(jìn)行定量。與其他提取物相比，Extr-4（異常黑膽質(zhì)成熟劑總酚提取物）能明顯降低HL-60細(xì)胞存活率，其24 h、48 h和72 h IC50分別為

17、105.7 μg/ml、95.1 μg/ml和72.3 μg/ml。
　　 3．體外抗癌活性試驗表明，六個SPE組分均可抑制HL-60細(xì)胞的體外生長，其中SPE-40對HL-60癌細(xì)胞增殖的抑制作用最強。薄層板噴以NP/PEG后，SPE-p、SPE-0、SPE-20、SPE-40和SPE-60均顯黃色斑點，SPE-80無黃色斑點。Extr-4和SPE-40與蘆丁在相同位置顯相同顏色的斑點。結(jié)果還顯示，SPE-40黃色斑點數(shù)量明顯

18、多于其余五個組分。
　　 4．運用ASE技術(shù)分別對組成異常黑膽質(zhì)成熟劑的中各單味藥進(jìn)行提取。結(jié)果表明，九味藥的CH2Cl2提取物除小茴香外均明顯降低HL-60癌細(xì)胞的存活率。在所有MeOH提取物當(dāng)中，只有甘草和地錦草等兩味藥MeOH提取物可降低HL-60癌細(xì)胞的存活率。各CH2Cl2提取物對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用均明顯強于其相對應(yīng)的MeOH提取物。對異常黑膽質(zhì)成熟劑不同提取物及單味藥的TLC分析結(jié)果表明，牛舌草、鐵線蕨、地

19、錦草和甘草含有酚類化合物，其中甘草尤其其CH2Cl2提取物顯明顯斑點。Extr-4與甘草在相同的位置顯相同顏色的斑點。SPE-40薄層色譜中黃酮類化合物的斑點的顏色和位置與地錦草、鐵線蕨、薰衣草相應(yīng)斑點相同。
　　 5．采用高效液相色譜二極管檢測技術(shù)從異常黑膽質(zhì)成熟劑中鑒定出8種酚類化合物，即咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖苷、迷迭香酸、木犀草素和芒柄花素；從SPE-p中檢出異槲皮苷和迷迭

20、香酸；從SPE-0和SPE-20兩個組分中均檢出咖啡酸、異槲皮苷、芹菜素7-O-葡萄糖苷和迷迭香酸；從SPE-40中檢出五種酚類化合物，即蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖苷和迷迭香酸；從SPE-60中檢出異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、木犀草素和芒柄花素等三種酚類化合物。
　　 結(jié)論：
　　 1．對異常黑膽質(zhì)成熟劑主要化學(xué)組分及其含量進(jìn)行了系統(tǒng)研究，建立了異常黑膽質(zhì)成熟劑總酚、總黃酮、總糖和總

21、皂苷含量測定方法，對異常黑膽質(zhì)成熟劑的物質(zhì)組成進(jìn)行了評價，研究方法及結(jié)果為異常黑膽質(zhì)成熟劑的組分分離和質(zhì)控方法提供了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，異常黑膽質(zhì)成熟劑主要由糖類、皂苷類、酚類（包括黃酮）和少量生物堿組成，其含量由大到小的順序依次為總糖、總皂苷、總酚、總生物堿，其中糖、皂苷和酚三者總重占總提取物重量的2/3。
　　 2．從異常黑膽質(zhì)成熟劑中提取了四種提取物，即Extr-1、Extr-2、Extr-3和Extr-4。化學(xué)組分的定性和定

22、量結(jié)果提示提取物1、3、4分別為總多糖、總皂苷、總酚提取物，其制備方法簡單，適于工業(yè)化生產(chǎn)。體外抗癌活性實驗結(jié)果表明，四種提取物中酚類化合物與異常黑膽質(zhì)成熟劑抑制癌細(xì)胞生長的作用之間存在著一定的相關(guān)性，而且Extr-4（異常黑膽質(zhì)成熟劑總酚提取物）對HL-60癌細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強于Extr-1、Extr-2和Extr-3。
　　 3．對總酚提取物進(jìn)行進(jìn)一步分離，得六個組分，其中固相萃取小柱以40%甲醇洗脫而得組分對HL-6

23、0癌細(xì)胞增殖的抑制作用最強，起作用具有時間依賴性。薄層色譜分析結(jié)果提示，該組分含有的黃酮類化合物的數(shù)量明顯多于其余組分，說明黃酮類化合物很可能是異常黑膽質(zhì)成熟劑活性組分或活性組分之一。
　　 4．體外抗癌活性實驗結(jié)果顯示，破布木果、地錦草、鐵線蕨、甘草、紅棗、薰衣草、牛舌草和蜜蜂花等八味藥的CH2Cl2提取物和甘草、地錦草兩味藥的MeOH提取物均能抑制HL-60癌細(xì)胞的增殖。各CH2Cl2提取物對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用均明

24、顯強于其相對應(yīng)的MeOH提取物，提示弱極性有機(jī)組分的體外抗癌活性可能強于強極性有機(jī)組分的體外抗癌活性。研究結(jié)果還提示，弱極性有機(jī)組分的體外抗癌活性可能強于強極性有機(jī)組分的體外抗癌活性。根據(jù)TLC分析結(jié)果，異常黑膽質(zhì)成熟劑活性部位中黃酮類化合物分別來自地錦草、鐵線蕨、薰衣草、牛舌草、小茴香和蜜蜂花中，其酚類化合物至少部分來自甘草。
　　 5．高效液相色譜分析結(jié)果證實，總酚提取物含咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、