TGF-β-,1-及其異構(gòu)體對HL-60細(xì)胞增殖的作用與機(jī)制研究.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)、生物學(xué)活性相近的多肽。在造血調(diào)控方面，主要發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，與正性細(xì)胞因子一起維持著造血細(xì)胞增殖和分化的平衡。在這個家族中有30多個成員，人體內(nèi)只存在有TGF-β<,1>、TGF-β<,2>、TGF-β<,3>三種異構(gòu)體，在調(diào)控細(xì)胞生長和分化方面具有不同的作用。TGF-β<,1>對白血病細(xì)胞有直接的抑制作用，而對于TGF-β<,1>的異構(gòu)體-TGF-β<,2>、TGF-β<,3>對白血病

2、細(xì)胞的作用研究國內(nèi)外還未見報道。有關(guān)它們在白血病細(xì)胞中的表達(dá)情況未見系統(tǒng)報道。這三種異構(gòu)體之間是否存在某種關(guān)聯(lián)目前也尚不清楚。ATRA和ATO是我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)的治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的有效藥物。有關(guān)內(nèi)源性細(xì)胞因子，特別是TGF-β<,1>是否參與了ATRA和ATO對白血病細(xì)胞的作用機(jī)制的報道也很少。 1．以HL-60細(xì)胞為研究對象，應(yīng)用生長曲線、MTT法、集落形成抑制試驗、NBT還原試驗、DNA ladder、流式細(xì)胞術(shù)等方法探

3、討TGF-β<,1>、TGF-β<,2>、TGF-β<,3>對白血病細(xì)胞分化和凋亡的影響；采用半定量RT-PCR方法研究這三種異構(gòu)體對bcl-2、c-myc、fas、bax等凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。 2．應(yīng)用實時定量RT-PCR和ELISA方法研究白血病細(xì)胞及血細(xì)胞分化各階段TGF-β<,1>及其異構(gòu)體的表達(dá)及其意義； 3．構(gòu)建針對不同靶位點的TGF-β<,1> RNAi質(zhì)粒，應(yīng)用實時定量RT-PCR和ELISA方法鑒定

4、基因沉寂效果及TGF-β<,1>表達(dá)被抑制后其異構(gòu)體表達(dá)的變化。應(yīng)用NBT還原試驗、流式細(xì)胞術(shù)等方法研究ATRA、ATO對采用siRNA方法抑制TGF-β<, 1>表達(dá)的HL-60細(xì)胞的作用。 取得了以下主要結(jié)果及結(jié)論： 1．TGF-β<,1>、TGF-β<,2>、TGF-β<,3>對HL-60細(xì)胞的增殖均有抑制作用，這種抑制作用具有劑量依賴性，其中TGF-β<,1>的抑制作用最強(qiáng)。在低濃度下，TGF-β<,1>可誘導(dǎo)H

5、L-60細(xì)胞出現(xiàn)分化，而TGF-β<,2>、TGF-β<,3>誘導(dǎo)分化的作用不如前兩者明顯。在高濃度下，三者均可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞出現(xiàn)一定程度的凋亡，也TGF-β<,1>的作用最明顯。它們可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因來誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控程度不同可能是這三種異構(gòu)體對HL-60細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)度不同的原因之一。 2．CD<,34><'+>細(xì)胞、BMNC、PLT、AL細(xì)胞、CML細(xì)胞均表達(dá)TGF-β<,1>、

6、TGF-β<,2>、TGF-β<,3>，其中越是成熟的細(xì)胞，TGF-β<,1>的表達(dá)水平越高；提示內(nèi)源性TGF-β<,1>在血細(xì)胞的成熟分化過程中可能起著重要的作用，其表達(dá)水平的降低在白血病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。TGF-β<,2>、TGF-β<,3>的表達(dá)水平在正常血細(xì)胞中的表達(dá)沒有這種趨勢，提示TGF-β<,2>、TGF-β<,3>在正常血細(xì)胞成熟分化過程中表現(xiàn)不活躍。CML細(xì)胞的TGF-β<,1>、TGF-β<,2>及TGF-β<

7、,3>表達(dá)比CD<,34><'+>細(xì)胞明顯降低，提示內(nèi)源性TGF-β<,2>、TGF-β<,3>的表達(dá)下降也可能在CML發(fā)病的機(jī)制中起一定的作用。 3．成功構(gòu)建針對不同靶位點的TGF-β<,1>的干擾表達(dá)質(zhì)粒，其中針對起始編碼區(qū)的干擾質(zhì)粒的抑制效率最高，對HL-60細(xì)胞TGF-β<,1>蛋白的抑制率為73.2％。 4．用RNAi技術(shù)使HL-60細(xì)胞中TGF-β<,1>基因表達(dá)下調(diào)時，TGF-β<,2>及β<,3>的表達(dá)并