TGF-βⅡ型受體異構(gòu)體在HL-60和Molt-4細(xì)胞中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、基于TGF-β1在白血病發(fā)病中的可能作用，研究了TGF-β受體（TGF-βreceptor，TβR）在白血病發(fā)病中的作用，特別是TβRⅡA和TβRⅡB兩種異構(gòu)體在白血病中的表達(dá)與調(diào)控。
　　本文的研究內(nèi)容主要分為以下三部分：
　　1.穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4細(xì)胞株的建立
　　(1)采用電穿孔的方法，分別將重組表達(dá)質(zhì)粒pEFIRES-N-TβRⅡA或pEFIRES-N-TβRⅡB轉(zhuǎn)染HL-

2、60和Molt-4細(xì)胞，用抗生素篩選出穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4細(xì)胞株。
　　(2)利用RT-PCR、Western-Blot鑒定抗性細(xì)胞中TβRⅡA和TβRⅡB的表達(dá)情況。
　　2.穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4細(xì)胞的體外生物學(xué)特性研究
　　(1)利用細(xì)胞計數(shù)法檢測 TGF-β1對穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA或TβRⅡB的 HL-60和Molt-4細(xì)胞的增殖的影響。

3、>　　(2)利用流式細(xì)胞儀，結(jié)合AO/EB法檢測TGF-β1對穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4細(xì)胞的凋亡的影響。
　　(3)利用流式細(xì)胞儀檢測TGF-β1對穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4細(xì)胞的周期的影響。
　　(4)利用實(shí)時定量PCR檢測TGF-β1對穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4細(xì)胞中的癌基因（bcl-2、c-myc、s100a6、p34）、抑癌基

4、因（p21、p27）和TGF-β信號通路基因（TβRⅠ、Smad4、Smad7）的表達(dá)的影響。
　　(5)利用Western-Blot方法檢測TGF-β1對穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4細(xì)胞中的C-myc、Bcl-2、Smad2、Smad3、Smad4等蛋白的表達(dá)的影響。
　　3.穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖情況的研究
　　利用裸鼠異種移植瘤模型，研究穩(wěn)定表達(dá)T

5、βRⅡA或TβRⅡB的HL-60細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)致瘤和增殖的情況。
　　取得了以下主要結(jié)果：
　　1.成功獲得穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60細(xì)胞和Molt-4細(xì)胞株，分別命名為：HL-60/pEFIRES-N細(xì)胞（轉(zhuǎn)染pEFIRES-N空質(zhì)粒的HL-60細(xì)胞）、HL-60/TβRⅡA細(xì)胞（轉(zhuǎn)染pEFIRES-N-TβRⅡA重組質(zhì)粒的HL-60細(xì)胞）、HL-60/pEFIRES-P細(xì)胞（轉(zhuǎn)染pEFIRES-P空質(zhì)粒的

6、HL-60細(xì)胞）、HL-60/TβRⅡB細(xì)胞（轉(zhuǎn)染pEFIRES-P-TβRⅡB重組質(zhì)粒的HL-60細(xì)胞）、Molt-4/pEFIRES-N細(xì)胞（轉(zhuǎn)染pEFIRES-N空質(zhì)粒的Molt-4細(xì)胞）、Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞（轉(zhuǎn)染pEFIRES-N-TβRⅡA重組質(zhì)粒的Molt-4細(xì)胞）、Molt-4/pEFIRES-P細(xì)胞（轉(zhuǎn)染pEFIRES-P空質(zhì)粒的Molt-4細(xì)胞）和Molt-4/TβRⅡB細(xì)胞（轉(zhuǎn)染pEFIRES-P-TβRⅡ

7、B重組質(zhì)粒的Molt-4細(xì)胞）。
　　2.細(xì)胞計數(shù)法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果表明：與對照組相比，在0ng/ml～12ng/ml的濃度范圍內(nèi)，TGF-β1對HL-60/TβRⅡA細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)，并呈現(xiàn)時間及劑量依賴性，而對HL-60/TβRⅡB細(xì)胞不產(chǎn)生明顯的增殖抑制作用。與此類似，與對照組相比，在0ng/ml～20ng/ml的濃度范圍內(nèi)，TGF-β1對Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)，并呈現(xiàn)時間及劑量依賴性，而對Mo

8、lt-4/TβRⅡB細(xì)胞的增殖抑制作用沒有Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞明顯。
　　3.細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明：與對照組相比，在0ng/ml～12ng/ml的濃度范圍內(nèi)，TGF-β1對 HL-60/TβRⅡA細(xì)胞的促凋亡作用增強(qiáng)，并呈現(xiàn)時間及劑量依賴性；當(dāng)10ng/ml TGF-β1處理24小時后，HL-60/TβRⅡA細(xì)胞的總凋亡率為2.34％，高于HL-60/TβRⅡB細(xì)胞的0.08%和HL-60細(xì)胞的0.06%；當(dāng)10ng/ml

9、 TGF-β1處理時間延長到96小時后，HL-60/TβRⅡA細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例為28.26%，高于HL-60/TβRⅡB細(xì)胞的21.44%和HL-60細(xì)胞的6.09%。與此類似，在0ng/ml～20ng/ml的濃度范圍內(nèi)，TGF-β1對Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞的促凋亡作用呈現(xiàn)時間及劑量依賴性；當(dāng)12ng/ml TGF-β1處理24小時后，Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞的總凋亡率為2.98%，高于Molt-4/TβRⅡB細(xì)胞的1.80

10、%和Molt-4細(xì)胞的0.16%；當(dāng)12ng/ml TGF-β1處理時間延長到72小時后，Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞總凋亡率為74.63%，顯著高于Molt-4/TβRⅡB細(xì)胞的48.82%和Molt-4細(xì)胞的17.88%。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果表明，10ng/ml的TGF-β1作用24～96小時后，與其它各組細(xì)胞相比，HL-60/TβRⅡA細(xì)胞中進(jìn)入S期的細(xì)胞比率降低，進(jìn)入G1期的細(xì)胞升高。并且HL-60/TβR

11、ⅡA細(xì)胞與其它組的差異隨著處理時間的延長而增加。TGF-β1作用24小時后，HL-60/TβRⅡA細(xì)胞中進(jìn)入S期的比例為47.51%，略低于HL-60細(xì)胞的55.46%和HL-60/TβRⅡB細(xì)胞的51.92%；TGF-β1作用96小時后，HL-60/TβRⅡA細(xì)胞中進(jìn)入S期的比例僅為20.20%，明顯低于HL-60細(xì)胞的58.35%和HL-60/TβRⅡB細(xì)胞的56.22%。與此類似，當(dāng)12ng/ml的TGF-β1作用24～96小時后

12、，與其它各組細(xì)胞相比，Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞中進(jìn)入 S期的細(xì)胞比率降低，進(jìn)入 G1期的細(xì)胞升高。在 TGF-β1作用24小時后， Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞中進(jìn)入S期的比例為32.58%，略低于Molt-4細(xì)胞的41.77%和Molt-4TβRⅡB細(xì)胞的36.83%；TGF-β1作用72小時后，Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞中進(jìn)入S期的比例僅為25.64%，明顯低于Molt-4細(xì)胞的49.87%和Molt-4/TβRⅡB細(xì)胞的34

13、.01%。
　　5.實(shí)時定量 PCR檢測結(jié)果顯示，10ng/ml TGF-β1作用96小時后，能夠在HL-60/TβRⅡA細(xì)胞中顯著下調(diào)bcl-2、c-myc、p34表達(dá)，顯著上調(diào)p21表達(dá)；而對HL-60/TβRⅡB和HL-60細(xì)胞的bcl-2、c-myc僅輕度下調(diào)，p21、p34表達(dá)無變化；TβRⅠ、Smad4、Smad7、s100a6、p27等基因在 HL-60/TβRⅡA、HL-60/TβRⅡB和HL-60細(xì)胞中均無變化。

14、12ng/ml TGF-β1作用72小時后，能夠在Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞中顯著下調(diào)c-myc的表達(dá)，顯著上調(diào)p21、p27表達(dá)；對 Molt-4/TβRⅡB細(xì)胞 c-myc的下調(diào)程度， p21、p27的上調(diào)程度不如Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞；Molt-4細(xì)胞c-myc、p21、p27無變化；TβRⅠ、Smad4、Smad7等基因在Molt-4/TβRⅡA、Molt-4/TβRⅡB和Molt-4細(xì)胞中均無變化；此外，利用熒光定量方

15、法檢測不到 bcl-2、s100a6、p34在各組 Molt-4細(xì)胞中的表達(dá)。
　　6. Western-Blot檢測結(jié)果顯示，在體外10ng/mlTGF-β1作用96小時后，能夠顯著下調(diào)Bcl-2、C-myc蛋白在穩(wěn)定表達(dá)HL-60/TβRⅡA的細(xì)胞中的表達(dá)，Smad2、Smad3、Smad4的表達(dá)無明顯差異；而在HL-60/TβRⅡB細(xì)胞中上述蛋白均無明顯變化。在體外12ng/ml TGF-β1作用72小時后，能夠顯著下調(diào)Bc

16、l-2和C-myc蛋白在Molt-4/TβRⅡA和Molt-4/TβRⅡB細(xì)胞中的表達(dá)，但是它們在Molt-4/TβRⅡA細(xì)胞中的下調(diào)趨勢更為顯著；此外，Smad2、Smad3、Smad4的表達(dá)在Molt-4/TβRⅡA和Molt-4/TβRⅡB細(xì)胞均無明顯差異。
　　7.裸鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組 HL-60/pEFIRES-N和HL-60/pEFIRES-P細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)組HL-60/TβRⅡA和HL-60/TβRⅡB細(xì)胞，

17、它們在裸鼠體內(nèi)平均成瘤時間分別為8.25天、8.88天、12.38天、10.25天，實(shí)驗(yàn)組和對照組相比成瘤時間明顯延長；接種22天后各組瘤塊平均體積分別為5.39±2.67cm3、5.15±2.87cm3、1.18±1.12cm3、3.31±2.37cm3，實(shí)驗(yàn)組和對照組相比瘤塊體積顯著減小（p＜0.05）；同時各組瘤塊平均重量分別為3.54±1.84g、3.46±1.61g、0.98±0.74g、2.15±1.43g，實(shí)驗(yàn)組和對照組相

18、比瘤塊重量顯著減輕（p＜0.05）。并且，與HL-60/TβRⅡB細(xì)胞相比，HL-60/TβRⅡA細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖能力明顯減弱。
　　結(jié)論：
　　TβRⅡA和TβRⅡB在功能上存在差異，穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡA的HL-60和Molt-4細(xì)胞對TGF-β1的敏感性提高，其在細(xì)胞增殖抑制及促凋亡作用均較穩(wěn)定表達(dá)TβRⅡB的HL-60和Molt-4細(xì)胞明顯。鑒于在白血病細(xì)胞中的表達(dá)以TβRⅡB為主，而在正常人造血干細(xì)胞以TβRⅡA為主