HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中NM23表達(dá)變化及其分子調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、背景： 急性髓細(xì)胞性白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)是一種嚴(yán)重危害人類健康的造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，大量未成熟髓細(xì)胞分化停滯、廣泛增殖，白血病細(xì)胞，增生積聚、浸潤其他組織器官，而正常造血受到抑制。根據(jù)阻滯階段的不同分為幾種亞型，常見的是M1-M5型。傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療雖然能使許多患者達(dá)到完全緩解，但具有胃腸道不適、骨髓抑制、肝腎功能損害等副作用，化療后骨髓抑制期易并發(fā)感染或DIC，引起早期死亡，多次

2、化療產(chǎn)生的耐藥性也容易導(dǎo)致復(fù)發(fā)，因此，需要研發(fā)新的高效安全藥物，并配合其他方法綜合治療。 自Leosachs提出惡性腫瘤細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為較成熟細(xì)胞以來，腫瘤誘導(dǎo)分化療法成為人類治療惡性疾病最為理想的方法之一。我國學(xué)者相繼首創(chuàng)全反式維甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)，并且獲得成功。上述兩種誘導(dǎo)分化劑的安全與有效應(yīng)用，極大的鼓舞和推動著國內(nèi)外學(xué)者從細(xì)胞分化調(diào)控的不同角度去探討新型誘導(dǎo)分化劑。

3、首先在中藥單體研究方面發(fā)現(xiàn)甙類、多糖類、膽酸鹽類、有機(jī)酸類、甾醇類對白血病細(xì)胞均具有誘導(dǎo)分化作用。其次是組蛋白去乙?；敢种苿?HDACIs)發(fā)展較快，能夠誘導(dǎo)多種類型的白血病細(xì)胞分化，其主要機(jī)制在于白血病細(xì)胞由于染色體易位等造成異常蛋白表達(dá)，引起組蛋白過度去乙酰化，而使基因轉(zhuǎn)錄受抑制，阻止白血病細(xì)胞分化的發(fā)生。因此，抑制HDAC活性，阻止組蛋白的去乙?；?，就可以誘導(dǎo)組蛋白的高乙?；癄顟B(tài)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，受抑基因得到表達(dá)，從而

4、促進(jìn)分化。但是，到目前為止，除了ATRA和As2O3成功用于急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)外，單獨(dú)的上述每種誘導(dǎo)分化劑均沒有取得令人鼓舞結(jié)果。更多的是傾向于不同誘導(dǎo)分化劑之間的聯(lián)合應(yīng)用。因此，誘導(dǎo)分化劑的聯(lián)合使用將成為腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化治療的新途徑，而不同誘導(dǎo)分化劑具體作用分子機(jī)制或關(guān)鍵靶位的確定，是影響高效誘導(dǎo)分化劑篩選和不同誘導(dǎo)分化劑有效組合的重要環(huán)節(jié)。但是，如何選擇研究的切入點(diǎn)成為能否揭示關(guān)鍵機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。 nm23基因，

5、1988年由美國國立癌癥研究所的steeg發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)它的高表達(dá)往往與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力呈反比，遂將此基因命名為nm23基因(non-metastasis編號為23的cDNA基因克隆)，隨著對nm23基因研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)nm23的表達(dá)水平、基因缺失、突變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著非常復(fù)雜的關(guān)系。有報(bào)道指出未分化的髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞能產(chǎn)生一種分化抑制因子，其中一種在急性髓細(xì)胞性白血病小鼠血漿中被提取、純化，并被證明是nm23基因的

6、同系物。近年來的臨床研究中發(fā)現(xiàn)nm23基因在AML中的表達(dá)水平高低和患者的預(yù)后有著明顯的反變關(guān)系。nm23基因家族已發(fā)現(xiàn)9個(gè)成員，但和腫瘤的的生物學(xué)特性關(guān)系較密切的是nm23-H1、nm23-H2。nm23-H1它編碼一種磷酸二核酸激酶(NDPK)的亞基，nm23蛋白可能可能通過NDPK一致或相似的途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳遞、細(xì)胞分化等過程。NDPK分布較廣，它可通過乒乓機(jī)制介導(dǎo)二磷酸與三磷酸核苷的相互轉(zhuǎn)化，從而維持細(xì)胞內(nèi)GTP池的平衡，影響

7、細(xì)胞內(nèi)的信號傳到途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。nm23-H2蛋白也就NDPKB，與c-myc基因的一種轉(zhuǎn)錄因子高度同源，該轉(zhuǎn)錄因子為一種嘌呤結(jié)合因子，它可通過與c-myc基因調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，調(diào)控c-myc及細(xì)胞生長相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞的分化狀態(tài)。上述研究結(jié)果均提示nm23基因有可能成為新型的誘導(dǎo)分化靶點(diǎn)。 目的： 本實(shí)驗(yàn)在以上研究背景的基礎(chǔ)上，以人急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞株為研究對象，建立曲古

8、霉素A和淫羊藿甙誘導(dǎo)分化模型，觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞增殖分化的改變，以及nm23-H1、nm23-H2基因在mRNA水平的表達(dá)變化，研究nm23在誘導(dǎo)分化過程中的表達(dá)變化，及其對下游G-CSF和c-myc基因表達(dá)的調(diào)控作用，探討上述不同來源誘導(dǎo)分化劑作用的關(guān)鍵分子機(jī)制，以及nm23基因作為誘導(dǎo)分化靶點(diǎn)的可能性。 方法： 取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，分別加入終濃度為0.2μmol/l的曲古霉素A(TSA)、200μg/ml的淫

9、羊藿甙(ICA)，于37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)1至3天，瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測細(xì)胞增殖變化，NBT還原實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞分化狀態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CD11b表達(dá)及細(xì)胞周期變化，RT-PCR檢測nm23-H1、nm23-H2、G-CSF、c-myc基因在mRNA水平的表達(dá)變化。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，以0.1％乙醇為溶劑對照組，以RPM1640為空白對照組。 結(jié)果： 曲古霉素A、淫羊藿甙作用后，HL-60細(xì)胞的

10、增殖均受抑制，NBT還原率增加，CD11b抗原表達(dá)升高，表明藥物產(chǎn)生誘導(dǎo)分化作用。nm23-H1、nm23-H2、c-myc基因表達(dá)均有不同程度地降低，G-CSF基因表達(dá)增強(qiáng)。其中，曲古霉素A作用最明顯。做相關(guān)分析表明，nm23-H1、nm23-H2基因與G-CSF基因表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，與c-myc基因表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示曲古霉素A、淫羊藿甙單獨(dú)作用與HL-60細(xì)胞能抑制其增殖，促進(jìn)其向成熟