bufalin在誘導(dǎo)人類(lèi)白血病HL-60細(xì)胞凋亡過(guò)程中下調(diào)Bcl-2表達(dá)激活PKCβⅡ.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文bufalin在誘導(dǎo)人類(lèi)白血病HL60細(xì)胞凋亡過(guò)程中下調(diào)Bcl2表達(dá)激活PKCβⅡ姓名：田昕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：劉云鵬2000.4.1材料與方法一藥品與器材蟾蛛靈、TPA、魚(yú)精蛋白、RNA酶、PI、胎牛血清、抗體、【，一PZ]ATPCo培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀、高速低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、電泳儀又光學(xué)顯微鏡、GDS8000圖象分析儀、液閃儀等。二.實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞培養(yǎng)人類(lèi)髓性白血病HL60細(xì)胞生

2、長(zhǎng)于含有10%熱滅活胎牛血清12Uml慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在379095%空y5%CO、飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)均采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。2.細(xì)胞生存率測(cè)定和形態(tài)學(xué)檢測(cè)用不同濃度的bufalin作用HL60細(xì)胞1一72小時(shí)，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞生存率，瑞氏一姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。3.流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期解析用不同濃度的bufalin作用HL一60細(xì)胞1一24小時(shí)后收集細(xì)胞，以冷磷酸緩沖液丈

3、PBS)，離心洗滌2次，加人體積比為70%的冷乙醇4℃過(guò)夜，冷PBS離心洗滌2次，加人RNA酶(200ELgml)37`C孵育1小時(shí)，加PI(20“nml)4`C避光染色30分鐘后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞周期。4.PKC活性測(cè)定1)細(xì)胞漿與細(xì)胞膜蛋白的分離提取取1x10.個(gè)細(xì)胞分別加人10一，M10一‘fm及100Mbufalin，不加任何處理因素的細(xì)胞為空白對(duì)照，培養(yǎng)60分鐘，以后的操作均在4℃以下進(jìn)行。分別提取胞漿和胞膜蛋白，蛋