雷公藤紅素誘導人急性髓系白血病HL-60細胞凋亡及其機制研究.pdf

1、白血病是最常見的惡性腫瘤之一,是一組異質(zhì)性起源的惡性克隆性疾病,年發(fā)病率3-4/10萬.目前治療白血病的方法主要是化療,化療主要是通過促進白血病細胞凋亡來達到治療白血病的目的.隨著化療方案的不斷改進和新化療藥物的出現(xiàn),白血病的預后已有非常明顯的改善,但仍然存在白血病耐藥及停藥后白血病復發(fā)等問題.例如,多種腫瘤細胞可對抗腫瘤藥物諸如長春新堿(VCR)、絲裂霉素C(MMC)和柔紅霉素(DAM)等產(chǎn)生耐藥性.因此,尋找抗腫瘤新藥、探索相關(guān)治療

2、新方案具有重要意義. 近年來,某些中藥及其有效組分因具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用備受關(guān)注.雷公藤泛指衛(wèi)矛科雷公藤屬植物,是我國傳統(tǒng)中藥材之一.雷公藤紅素是雷公藤單體之一,屬三萜類色素,分子式為C29H3804,分子量為450.有文獻報道,雷公藤紅素不僅具有免疫抑制和抗炎作用,也可顯示體外抗腫瘤活性,但其機制尚未完全明了.本研究以人急性髓系白血病HL-60細胞為靶細胞,采用流式細胞術(shù)和透射電鏡法等方法,探討了雷公藤紅素誘導HL-60

3、細胞凋亡的量效及時效關(guān)系,此外還檢測了雷公藤紅素處理前后對HL-60細胞Fas、FasL和INF-κBP65表達水平的影響,以期了解雷公藤紅素誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制. 材料和方法: 1.HI-60細胞培養(yǎng)及處理: 24孔細胞培養(yǎng)板中每孔接種1×10<'6>/ml的HL-60細胞,37℃、5﹪CO<,2>條件下預培養(yǎng)24 h.試驗組加入終濃度分別為0.5、1.0、1.5和2.0/μmol/L的雷公藤紅素,實驗中

4、同時設(shè)置不加藥物的對照組,37℃、5﹪CO<,2>培養(yǎng)24 h后收集細胞.另將HI,-60細胞與終濃度為1.5μmol/L雷公藤紅素分別培養(yǎng)0、4、8、12、16、24 h.所收集的細胞用PBS洗滌2次后重懸,調(diào)整細胞濃度為1×10<'6>/ml. 2.腫瘤細胞殺傷試驗采用臺盼蘭染色活細胞計數(shù)法.取30μl不同濃度雷公藤紅素處理前后細胞懸液,用臺盼藍染色后鏡檢100個細胞并計算活細胞百分率,其中拒染細胞為活細胞,染成藍色的細胞為

5、死細胞. 3.腫瘤細胞凋亡檢測采用FiTC-annexin V/PI流式細胞法.取上述不同濃度雷公藤紅素處理及同一濃度雷公藤紅素作用不同時間的HL60細胞懸液100μl,分別加入10μlFITC-annexin V,37℃孵育10 min,PBS洗滌后重懸細胞,加入PI終止液50μl,用流式細胞儀檢測. 4.透射電鏡觀察取1.5 ℃mol/L雷公藤紅素處理0和24 h的細胞離心后棄上清,沉淀用預冷的0.01 mol/L

6、PBS(pH 7.4)離心洗滌細胞2次,2.5﹪戊二醛磷酸緩沖液4℃固定細胞4 h,超薄切片后用透射電鏡觀察細胞形態(tài)學變化. 5.Fas和FasL檢測分別取1.5μmol/L雷公藤紅素處理0、12和24 h的細胞懸液100μl,分別加入FITC標記的Fas或FasL單克隆抗體10μl,以IgGl-FITC為陰性對照,37℃孵育30 min后用流式細胞儀檢測,分別定量分析不同標本中Fas和FasL陽性細胞百分率. 6.NF

7、-κBP65活性的檢測分別取1.5μmol/L雷公藤紅素處理0、12和24 h的細胞懸液100μl,加入兔抗人NF-κBP65單克隆抗體100μl,室溫孵育30 min后用PBS洗滌2次,然后加入FITC標記鼠抗兔單克隆抗體,室溫避光孵育30 min,PBS洗滌2次,用1﹪副醛固定細胞后用流式細胞儀檢測,定量分析不同標本中NF-κBP65陽性細胞百分率. 結(jié)果: 1.不同藥物濃度及作用時間與細胞凋亡率變化的關(guān)系臺盼藍染色

8、結(jié)果表明,0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μmol/L雷公藤紅素作用24 h后,HL-60活細胞百分率分別為93.1±1.4、92.1±1.1、86.4±1.4、84.1±1.7、80.2±1.5,未受雷公藤紅素作用的正常HL-60活細胞百分率為98.3±0.6.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,HL-60細胞凋亡率分別為6.13±0.83、14.31±1.35、36.71±2.28、31.85±2.06、20.17±2.19,與對照組1

9、.97±0.64相比其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).其中藥物濃度為0.5～1.5 μmol/L時,細胞凋亡率隨藥物濃度的增加而升高,藥物濃度≥2.0 μmol/L時,細胞凋亡率隨藥物濃度增加而下降.1.5μmol/L雷公藤紅素分別作用4、8、12、16、24 h時,其凋亡率分別為2.67±0.26、7.44±0.66、12.68±1.15、22.10±0.95、38.53±1.83,與對照組1.92±0.26相比差異有統(tǒng)計學意義(P

10、<0.05). 2.細胞形態(tài)學觀察結(jié)果正常HL-60細胞呈較為均一的圓形或橢圓形.1.5 μmol/L,雷公藤紅素分別處理16和24 h后,均可見細胞圓縮、大量胞漿內(nèi)空泡,并出現(xiàn)染色體邊集、細胞核形成新月體形等典型的細胞凋亡形態(tài)學變化,部分細胞細胞核內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體,隨作用時間延長上述病變更為明顯. 3.Fas、Fasl,和NF-KBP65陽性細胞百分率1.5μmol/L雷公藤紅素分別作用12和24h后,HL-60細胞Fa

11、s和FasL表達明顯增強,其中Fas陽性細胞百分率分別為47.91±1.21、65.74±1.20,與對照組14.23±1.42相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);FasL陽性細胞百分率分別為37.92±1.73、43.50±2.11,與對照組15.61±1.10相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).1.5/μmol/L雷公藤紅素作用24 h時,NF-KBP65陽性HL-60細胞率為4.78±0.30,與對照組8.34±1.52相比,

12、明顯低于對照組(P<0.05). 結(jié)論: 1.雷公藤紅素在一定的濃度范圍內(nèi)(0.5～1.5μmol/L),均可誘導HL-60細胞凋亡并呈濃度依賴效應(yīng),且藥物濃度為1.5μmol/L時細胞凋亡率最高.當雷公藤紅素濃度≥2.0/μmol/L時,HL-60細胞凋亡率不升反降,提示雷公藤紅素作用HL60細胞時,可能存在有效濃度閾值現(xiàn)象.當雷公藤紅素濃度為1.5μmol/L時,HL-60細胞凋亡率呈現(xiàn)作用時間依賴效應(yīng). 2