血紅素加氧酶-1抑制急性髓系白血病細胞凋亡的作用及機制研究.pdf

1、目的：本實驗研究血紅素加氧酶-1（HO-1）在急性髓系白血病（AML）細胞中的表達情況，隨之通過調控HO-1在AML細胞中的表達，證實HO-1抑制AML細胞凋亡的作用，并探討HO-1抑制AML細胞凋亡的信號通路。
　　方法:本實驗分為兩部分：體外實驗和體內實驗。在體外實驗中，一方面以初診或復發(fā)的AML患者（原始細胞大于60％）的骨髓血作為標本，免疫磁珠分選CD34+白血病細胞，采用Real-time PCR法和Western bl

2、ot法檢測HO-1在mRNA和蛋白水平的表達情況；另一方面體外培養(yǎng)AML白血病細胞株HL-60及U937，檢測HO-1在其中的表達，通過慢病毒轉染分別上調/下調HO-1的表達，給予不同濃度阿糖胞苷誘導各組細胞凋亡,采用MTT法和Annexin V/7-AAD雙染色法檢測各組細胞存活率及凋亡率，并通過Western blot檢測各組細胞中HO-1與凋亡蛋白caspase3、caspase8、caspase9的相關性。在體內實驗中，采用SC

3、ID小鼠，通過皮下注射不同處理組的U937細胞，建立AML小鼠模型，并檢測不同組小鼠的生存時間、腫瘤體積的大小及脾臟重量指數，以及通過病理檢測對比各組小鼠腫瘤及脾臟中白血病細胞的侵潤情況。最后采用Western Blot法檢測AML病人樣本、AML細胞株及AML小鼠模型皮下腫瘤中HO-1及相關通路蛋白如JNK、pJNK Thr183/Tyr185、p38、p-p38、ERK1/2、pERK1/2等的表達情況。
　　結果：1.HO-

4、1在AML病人中多呈高表達。32例AML病人標本中，檢測發(fā)現(xiàn)有23例(占70%)AML病人HO-1在mRNA及蛋白水平均呈高表達，尤其9例急性單核細胞白血?。∕5）患者HO-1的表達更是明顯升高。2.HO-1的高表達抑制HL-60及U937細胞的凋亡。給予相同濃度的阿糖胞苷處理不同組細胞，MTT結果顯示過高表達HO-1組細胞存活率明顯高于其他組（P<0.05），采用Annexin V/7-AAD雙染色法進一步證實高表達HO-1組細胞的凋

5、亡率最低（P<0.05）。并且發(fā)現(xiàn)HO-1與凋亡蛋白caspase3、caspase8、caspase9的表達呈負相關。3.在體內，過高表達HO-1加速白血病的進展。與低表達HO-1組相比，過高表達HO-1組AML小鼠模型的腫瘤生長更快、脾臟明顯增大及生存時間明顯縮短。4.HO-1導致JNK/c-JUN信號通路的激活，調控HO-1的表達后，在臨床標本、細胞株及小鼠模型的腫瘤組織中檢測均發(fā)現(xiàn)HO-1的表達與JNK、磷酸化JNK、總c-JU

6、N及磷酸化c-JUN蛋白表達呈正相關，并且抑制HO-1的表達，上述通路蛋白的表達水平明顯下降，而抑制JNK的表達，HO-1的表達無明顯變化，從而證實HO-1在JNK/c-JUN通路的上游。
　　結論：HO-1在AML病人中多呈高表達，而且能夠抑制白血病細胞的凋亡，最終發(fā)現(xiàn)HO-1通過激活 JNK/c-JUN信號通路發(fā)揮其抗凋亡的作用。沉默HO-1的表達促進AML白血病細胞的凋亡、抑制AML小鼠模型白血病的進展，因此HO-1有望成為