Fenretinide對(duì)靜止期急性髓系白血病細(xì)胞的特異性殺傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、fenretinide特異性殺傷靜止期HL-60細(xì)胞及其機(jī)制研究
　　化療耐藥是急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）臨床治療工作中亟需解決的問題。目前臨床一線化療藥物都是細(xì)胞周期依賴性藥物，大部分只對(duì)增殖期AML細(xì)胞有效，而對(duì)處于相對(duì)靜止期的AML細(xì)胞效果很差，這是AML化療失敗的原因之一。因此，開發(fā)一種既是周期非依賴，又能通過其他途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的新型化療藥物對(duì)于克服耐藥、改善AML治

2、療有著積極意義。Fenretinide（N-（4-hydroxyphenyl）retinamide,4-HPR）作為新型維甲酸衍生物，具有通過誘導(dǎo)活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的產(chǎn)生殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。除了對(duì)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用外，fenretinide還同時(shí)具有靶向白血病干細(xì)胞和預(yù)防腫瘤發(fā)生/復(fù)發(fā)的作用，從而顯示出其殺傷相對(duì)靜止的腫瘤細(xì)胞的潛力。時(shí)至目前，有關(guān)fenretinide對(duì)同一腫瘤

3、中不同周期狀態(tài)細(xì)胞的毒性差異及其差異機(jī)制仍不清楚。
　　為了在同一腫瘤特征的細(xì)胞平臺(tái)上探究fenretinide對(duì)增殖期和相對(duì)靜止期AML細(xì)胞的毒性差異及相關(guān)機(jī)制，本研究通過血清饑餓法誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞周期同步化，建立了周期相對(duì)靜止的AML細(xì)胞模型。在此基礎(chǔ)上，我們借助流式細(xì)胞術(shù)、集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)fenretinide對(duì)周期狀態(tài)不同的HL-60細(xì)胞活力、功能方面的影響并進(jìn)行作用差異原因的探究，進(jìn)而通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白印跡法

4、等探討其殺傷相關(guān)細(xì)胞群體的機(jī)制。
　　本研究的結(jié)果顯示：fenretinide對(duì)相對(duì)靜止的HL-60細(xì)胞具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡和集落形成抑制作用，并且在該細(xì)胞群體中誘導(dǎo)出了更高的ROS增幅。Fenretinide誘導(dǎo)相對(duì)靜止HL-60細(xì)胞凋亡的過程伴隨著胞內(nèi)ROS的快速積累和NF-κB亞基與靶基因表達(dá)的下調(diào)。據(jù)此我們主要得出以下結(jié)論：1、fenretinide對(duì)慢增殖HL-60細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)于快增殖細(xì)胞，這可能與前者在藥物作用下產(chǎn)生

5、更多ROS有關(guān)。2、fenretinide通過誘導(dǎo)ROS和抑制NF-κB信號(hào)通路殺傷慢增殖HL-60細(xì)胞。這些結(jié)論提示：fenretinide作為一種周期非依賴性新型化合物，能夠靶向相對(duì)靜止的AML細(xì)胞發(fā)揮作用，在克服化療耐藥和復(fù)發(fā)方面具有較高的臨床轉(zhuǎn)化潛質(zhì)。
　　第二部分、急性髓系白血病細(xì)胞分子遺傳學(xué)特征與其對(duì)fenretinide反應(yīng)性之間的關(guān)系研究
　　基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)的急性髓系白血?。╝

6、c ute myeloid leukemia,AML）精確分型是明確診斷、判斷危險(xiǎn)度、制定化療方案的重要依據(jù)，同時(shí)也是以臨床AML樣本為對(duì)象的化療藥物研究的重要資料。傳統(tǒng)的依據(jù)患者細(xì)胞核型進(jìn)行危險(xiǎn)度分層的方法具有一定局限性，即核型正?；颊叩念A(yù)后也存在很大異質(zhì)性。近年來，第二代DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得FLT3、NPM1、CEBPA等眾多與AML發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因突變被發(fā)現(xiàn)，其中一些已經(jīng)成為預(yù)后判斷的重要依據(jù)。各種基因突變的發(fā)生分別從不同角

7、度參與了對(duì)AML發(fā)生發(fā)展的影響，可能涉及到不同化療藥物發(fā)揮作用的信號(hào)通路。因此，細(xì)化AML樣本的分子遺傳學(xué)特征有助于加深對(duì)疾病發(fā)生機(jī)制和生物學(xué)特征的認(rèn)識(shí)，對(duì)AML化療藥物相關(guān)研究大有裨益。但是，在fenretinide殺傷原代AML細(xì)胞過程中，其對(duì)攜帶不同基因突變的樣本是否具有作用效果的差異，現(xiàn)在仍不清楚。
　　為了明確攜帶不同基因突變的AML樣本對(duì)fenretinide處理是否具有敏感性差異，本研究收集了32例原代AML樣本，借

8、助流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了其在fenretinide作用下活力變化情況，同時(shí)通過PCR實(shí)驗(yàn)和測(cè)序、比對(duì)的方法對(duì)樣本的FLT3-ITD/TKD、NPM1、NRAS、IDH1、CEBPA等基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)，最后對(duì)兩部分信息進(jìn)行匯總分析。
　　本研究的結(jié)果顯示：原代AML CD34+CD38-細(xì)胞在fenretinide處理下顯示出程度不一的活力下降現(xiàn)象。攜帶FLT3突變的樣本的活力下降幅度顯著大于FLT3野生型樣本，這種差異未在其他基因