IL-35誘導急性髓細胞白血病細胞免疫逃逸的作用及機制.pdf

1、急性髓細胞白血?。ˋcute Myeloid Leukemia, AML）是最常見的成人血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病機制復雜，基因突變、遺傳物質異常以及免疫功能缺陷等因素均是造成 AML完全發(fā)病的重要因素。CD4+CD25+調節(jié)性 T細胞（CD4+CD25+Regulatory T Cells, Tregs）是一群具有免疫抑制作用的特殊細胞亞群，其既可以通過細胞-細胞接觸方式直接殺傷效應性免疫細胞，又可以通過分泌 IL-10和TGF-β等細

2、胞因子以非細胞接觸方式抑制免疫應答，從而在誘導和維持機體的免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用。我們前期工作基礎和其他學者多項研究均表明，初診AML患者外周血和骨髓中Tregs比例均顯著高于健康對照組，其不僅顯著抑制 CD4+CD25-效應性T細胞（CD4+CD25-Effector T Cells, Teffs）的增殖和分泌細胞因子，還顯著抑制過繼性輸入的腫瘤抗原特異性細胞毒性 T淋巴細胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL

3、s）的增殖和擴散，故Tregs被認為是誘導AML細胞逃逸機體抗腫瘤免疫應答的關鍵因素，為AML患者提供了一個潛在的治療靶點。然而，最新研究表明單純利用抗 CD25單克隆抗體或者白喉毒素/IL-2融合蛋白等方法去除Tregs，還是只能給 AML荷瘤小鼠帶來短暫性療效，因為腫瘤微環(huán)境能夠很快再次誘導Tregs的表達；同時，利用中和性抗體的方法中和掉IL-10或TGF-β的活性，也并不能完全阻斷Tregs的免疫抑制作用，這提示Tregs的體內

4、表達調控網絡非常復雜，而且除了經典的抑制性細胞因子IL-10和TGF-β，或許還有其他細胞因子介導了它的免疫調節(jié)作用，這給以其為靶點的AML治療帶來了實際困難。
　　IL-35是一種近年發(fā)現(xiàn)的的新型細胞因子，其屬于 IL-12細胞因子家族，由IL-12α亞基p35和IL-27β亞基EB病毒誘導的基因3（Epstein-Barr Virus Induced Gene3, EBI3）以異二聚體形式組成。在細胞來源方面，目前研究表明小鼠

5、IL-35可能特異性來源于Tregs，但人Tregs是否產生IL-35目前尚存在爭議，且基因組學研究提示除Tregs之外，IL-35可能有著更為廣泛的細胞來源；在生物學功能方面，IL-35被認為具有強大的免疫抑制作用，其不僅能直接抑制 Teffs的分化、增殖和分泌細胞因子，又能招募髓系來源的抑制性細胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）聚集并促進血管生成，還能促進Tregs的增殖并為其發(fā)揮最

6、大免疫抑制功能所必需，甚至還能誘導產生一種 Tregs新亞群“iTr35”（IL-35 Induced Regulatory T Cells, iTr35），從而級聯(lián)放大Tregs的免疫調節(jié)作用。綜上所述，IL-35作為 IL-12細胞因子家族的一個新成員，其無論是來源方面還是功能方面，均與Tregs密切相關。因此，我們認為IL-35的發(fā)現(xiàn)正好為闡明Tregs在AML中的表達調控及作用機制帶來了良好的契機，本文即以此為出發(fā)點來展開研究，

7、以期進一步揭示AML細胞的免疫逃逸機制，并同時探討通過干預IL-35的表達而提高免疫細胞殺傷AML細胞能力的方法，以期為AML免疫治療提供實驗基礎和新思路。
　　本研究共收集了28例初診成人AML患者及其在首次獲得完全緩解（27例）和首次復發(fā)（7例）時的外周血標本，同時選擇了30例年齡匹配的健康成年人外周血標本作為對照，然后對IL-35在AML中的表達、來源、誘導AML細胞免疫逃逸的作用和機制，以及干預IL-35的表達對免疫細胞殺

8、傷AML細胞活性的影響進行了分析。具體實驗方法和實驗結果如下：
　?。?）我們通過對常見免疫細胞及其相關細胞因子的檢測，發(fā)現(xiàn)AML患者外周循環(huán)中NKT、B、CD8+T、總CD4+T、Th1、Th17、IL-15、sCD25、IL-2、IFN-γ以及 IL-17等效應性免疫細胞和炎癥因子明顯低于健康對照組，而Th2、Tregs、IL-4、IL-10以及TGF-β等調節(jié)性免疫細胞和抗炎因子明顯高于健康對照組，這提示AML患者處于明顯的

9、免疫功能紊亂狀態(tài)，有利于AML細胞逃逸機體的抗腫瘤免疫應答反應而得到惡性生長和增殖。
　?。?）我們通過多種實驗方法對IL-35蛋白和mRNA的分析，發(fā)現(xiàn)初診AML患者的IL-35表達水平與健康對照組相比顯著升高，且在獲得完全緩解后降低，而復發(fā)時再度升高，這提示AML患者體內存在IL-35的高表達且與其疾病發(fā)生發(fā)展密切相關，可能是介導AML細胞免疫逃逸的重要因素。
　?。?）我們分離純化了部分初診AML患者的Tregs、Te

10、ffs以及AML細胞，并將其進行了短期的體外培養(yǎng)和刺激，然后在靜息和活化狀態(tài)下對它們是否表達IL-35做了檢測，結果發(fā)現(xiàn)Tregs在靜息狀態(tài)下不表達IL-35但經活化后顯著表達，同時部分患者來源的AML細胞亦表達IL-35，但Teffs無論是靜息還是活化狀態(tài)下均不表達IL-35；另外，我們還檢測了AML患者體內iTr35的表達水平，發(fā)現(xiàn)其顯著高于健康對照組且在靜息和活化狀態(tài)下均表達IL-35；這提示AML中Tregs、iTr35和AML

11、細胞均是IL-35表達的細胞來源之一。
　?。?）我們通過Teffs、Tregs和iTr35體外刺激實驗或細胞共培養(yǎng)實驗，發(fā)現(xiàn)IL-35顯著抑制Teffs的增殖及其殺傷AML細胞的活性，同時又顯著促進Tregs和iTr35的擴增，并且這種IL-35擴增的Tregs和iTr35對Teffs的增殖具有顯著抑制作用，這提示IL-35不僅能直接抑制Teffs的免疫應答，還能促進Tregs和iTr35的表達和功能，從而介導了AML細胞免疫逃

12、逸。
　　（5）我們通過對IL-35刺激的AML細胞增殖和凋亡情況進行分析，發(fā)現(xiàn)IL-35顯著上調AML細胞中IL-35R的表達，同時與PBS對照組相比IL-35還顯著促進AML細胞的增殖，而且發(fā)現(xiàn)用IL-35預刺激的AML細胞能顯著抵抗VP-16誘導的凋亡，這提示IL-35可以通過結合其受體直接作用于AML細胞，并顯著促進AML細胞的增殖和抑制AML細胞的凋亡。
　?。?）細胞因子誘導的殺傷細胞（Cytokine-Indu

13、ced Killer Cells, CIK）是AML過繼性細胞免疫治療的首選方案，然而其療效有待進一步提高。本研究中我們通過免疫表型分析和細胞因子檢測，發(fā)現(xiàn)體外擴增的CIK細胞中包含有大量的Tregs及其分泌的IL-35，嚴重影響了其最大免疫殺傷活性；故我們在實驗中對體外制備CIK細胞的培養(yǎng)方案進行了優(yōu)化，即將方案中的淋巴細胞活化因子由IL-2更換成了IL-15，結果發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)IL-2擴增的CIK細胞相比，IL-15擴增的CIK細胞中T

14、regs和IL-35的表達顯著下調，但對AML細胞的殺傷活性卻顯著增強，這提示干預Tregs和IL-35的表達能顯著提高CIK細胞殺傷AML細胞能力。
　　（7）將樹突狀細胞（Dendritic Cells, DCs）與CIK細胞聯(lián)合培養(yǎng)（即DC-CIK細胞）是近年進一步活化CIK細胞的有效方法，其可以通過抗原提呈途徑顯著增強 CIK細胞的抗腫瘤能力，然而通過DC-CIK細胞與CIK細胞的生物特性及其對AML細胞抗腫瘤活性的比較分

15、析，我們發(fā)現(xiàn)與CIK細胞相比，DC-CIK細胞中Tregs和IL-35的表達顯著下調，但對AML細胞的殺傷活性卻顯著增強，這提示通過下調Tregs和IL-35的表達也是DCs提高CIK細胞對AML細胞殺傷活性的重要途徑之一。
　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)，AML患者體內存在嚴重的免疫功能紊亂，其中，近年發(fā)現(xiàn)的新型細胞因子IL-35表達水平顯著升高且與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關；這些IL-35既可以來源于Tregs和iTr35，又可以來源于部分A

16、ML細胞；IL-35可以通過抑制Teffs和促進 Tregs和iTr35的表達和功能以及直接促進 AML細胞的增殖和抑制AML細胞的凋亡來誘導AML細胞的免疫逃逸；同時，Tregs及其分泌的IL-35還是影響CIK細胞殺傷AML細胞活性的重要因素，而通過利用IL-15替代IL-2制備的CIK細胞或將CIK細胞與DCs共培養(yǎng)，可以通過下調Tregs和IL-35的表達而顯著提高其殺傷AML細胞的能力。因此，我們認為IL-35在AML細胞免疫