慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞分泌的exosome的抗白血病作用研究.pdf

1、慢性髓細(xì)胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)是一種起源于多能造血干細(xì)胞的惡性增生性疾病，目前尚無理想的根治手段。大量的臨床及實驗室證據(jù)表明，CML細(xì)胞具有免疫原性，能夠成為抗白血病細(xì)胞免疫治療的靶點。采用過繼性免疫治療，輸注抗白血病特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，可以清除這些患者的殘留病灶。近年來，腫瘤細(xì)胞分泌的小囊泡exosome在腫瘤模型中發(fā)揮的免疫刺激功能引起了人們的廣泛關(guān)注。Exosome表達(dá)抗原呈遞相關(guān)分子，

2、帶有相關(guān)的腫瘤抗原信息，具有抗原提呈能力，使其有可能成為免疫治療中誘人的載體。 第一部分實驗，采用離心超濾和蔗糖密度梯度離心等方法分離出5例慢性髓細(xì)胞白血病慢性期患者CML細(xì)胞和K562細(xì)胞釋放的exosome，經(jīng)透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。采用固相免疫電鏡法(solidphaseimmunoelectronmicroscopicmethod，SPIEM)制備CML-exosome的HSP70，ICAM-1及ABL免疫電鏡標(biāo)本。采用

3、Westernblot方法檢測CML-exosome是否表達(dá)HSP70及MHC-Ⅰ。結(jié)果顯示：CML細(xì)胞及K562細(xì)胞分泌的exosome為直徑50～100nm的膜性微囊，圓形或橢圓形，腔內(nèi)為低電子密度成分。CML-exosome經(jīng)抗HSP70、ICAM-1和ABL抗體-膠體金免疫電鏡標(biāo)記，囊外膜及腔內(nèi)可見點狀、顆粒狀電子致密物沉積。Westernblot結(jié)果顯示CML-exosome中較白血病細(xì)胞凍融物(autogenous-leuk

4、emiccellslysates，ACL)含有更多的HSP70和MHC-Ⅰ。 第二部分實驗，為探討患者自體自血病細(xì)胞來源的exosome(CML-exosome)致敏CML患者外周血單個核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞(CML-DC)，能否進(jìn)一步提高細(xì)胞毒T細(xì)胞的殺傷活性。將CML患者的外周血單個核細(xì)胞，用IL-4、GM-CSF和TNF-α三種細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)出形態(tài)和表型為DC的細(xì)胞。采用MTT法檢測在效靶比為12.5∶1、25∶1、

5、50∶1時，T細(xì)胞+exosome-CML-DC組對CML靶細(xì)胞的殺傷率分別為(20.3±3.8)％、(32.9±3.4)％、(64.8±2.0)％，T細(xì)胞+CML-DC組分別為(12.8±1.7)％、(28.5±2.3)％、(38.7±2.2)％，二者比較有顯著性差異(P＜0.05)。以MTT法測定exosome-CML-DC和CML-DC對自體T細(xì)胞的促增殖活性。結(jié)果表明exosome致敏的CML-DC較CML-DC具有更強的激活C

6、TL的能力。 第三部分實驗，研究臍血樹突狀細(xì)胞(cordblooddendriticcell,CBDC)負(fù)載CML-exosome，是否可從臍血中誘導(dǎo)生成特異性殺傷CML白血病細(xì)胞的CTL細(xì)胞。常規(guī)方法從臍血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)DC并分離T細(xì)胞，將CML-exosome致敏或白血病細(xì)胞凍融物(ACL)致敏的CBDC與T細(xì)胞共培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表型，MTT比色法檢測體外細(xì)胞毒活性，測定exosome-CBDC和ACL-CBDC對臍

7、血T細(xì)胞的促增殖活性。結(jié)果顯示：臍血樹突狀細(xì)胞同樣表達(dá)DC表面標(biāo)志物CD1a、HLA-DR、CD83、CD86，具有典型DC的形態(tài)特征。在各效靶比下，exosome-CBDC激活的T細(xì)胞對白血病細(xì)胞的殺傷活性明顯強于ACL-CBDC激活的T細(xì)胞(P＜0.05)。在細(xì)胞毒性實驗中，以1例達(dá)完全細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)后的CML患者的PBMNC作為靶細(xì)胞，觀察到exosome-CBDC激活的T細(xì)胞對非白血病細(xì)胞的低殺傷性。抗體阻斷實驗結(jié)果表明CD8+

8、T細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞，細(xì)胞毒作用主要通過MHC-Ⅰ分子介導(dǎo)。 以上結(jié)果提示：(1)離心超濾和蔗糖密度梯度離心法純化小量exosome方法簡便可行。(2)CML-exosome表達(dá)ABL、HSP70、ICAM-1及MHC-Ⅰ分子，具有免疫原性，從而區(qū)別于細(xì)胞其他分泌產(chǎn)物。(3)CML-exosome致敏CML-DC能進(jìn)一步提高CML-DC活化CTL的能力。(4)CML-exosome致敏臍血樹突狀細(xì)胞，可從臍血中誘導(dǎo)生成特異性殺