miR-99a在兒童急性髓性白血病和慢性粒細胞性白血病的表達和功能研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼短鏈RNA，長度為19～25個核苷酸，可在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，其主要功能是miRNA與靶基因3′端非翻譯區(qū)(3′Untranslated region，3′-UTR)結(jié)合，并通過降解靶基因或者抑制靶基因翻譯來實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人類miRNA有700多個左右，調(diào)控基因組中大約1/3的蛋白編碼基因，廣泛參與細胞增殖、分化和凋亡等一系列重要生命過程。近來

2、研究表明，大約有50％已注釋的miRNA位于和癌癥相關(guān)的基因脆性位點及基因組區(qū)域中，在癌癥中起著原癌基因或者抑癌基因的作用，而且在許多惡性腫瘤包括白血病中已經(jīng)鑒定出與疾病的診斷、發(fā)展、治療反應(yīng)及預后相關(guān)的miRNA表達譜，本研究團隊發(fā)表的前期研究工作亦支持這些結(jié)果。白血病在我國兒童的惡性腫瘤中發(fā)病率最高，而且兒童與成人白血病在生物學特性、治療反應(yīng)和預后等方面有明顯的不同。然而，目前許多實驗都基于對成人白血病的研究，而對兒童白血病相關(guān)mi

3、RNA的研究較少，很多與兒童急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和慢性粒細胞性白血病(chronicmyelogenous leukemia，CML)相關(guān)的miRNA未被鑒定。因此，很有必要專門發(fā)掘和分析與兒童白血病相關(guān)的miRNA，并對其作用和機制進行深入研究，從非蛋白編碼基因的分子水平闡明兒童白血病的本質(zhì)。
　　 本研究收集了68例兒童AML和12例兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜(作為對照組)的

4、骨髓樣本，其中18例兒童初發(fā)AML和5例對照組樣本用miRNA芯片技術(shù)分析miRNA表達譜，50例兒童AML和7例對照組樣本用qRT-PCR方法進一步驗證miR-99a的表達并分析其功能。另外，亦收集了12例兒童CML骨髓樣本用qRT-PCR方法研究miR-99a的表達并分析其功能。結(jié)果如下：
　　 (1)miRNA芯片揭示兒童初發(fā)AML存在特異性的miRNA表達譜。對18例兒童初發(fā)AML和5例對照組樣本的576個人類成熟miR

5、NA的表達譜進行分析，篩選并獲得了在兒童初發(fā)AML中特異高表達的miRNA是miR-99a、miR-100、miR-125b、miR-335和miR-146a等，其中miR-99a的表達在兒童和成人白血病患者中均未見報道。
　　 (2)qRT-PCR技術(shù)印證miRNA芯片所顯示的miR-99a在兒童初發(fā)AML中高表達，并揭示其在不同疾病階段表達水平不同。qRT-PCR技術(shù)顯示miR-99a在所有兒童初發(fā)AML中高表達，與基因芯片

6、結(jié)果一致，而在91％AML CR患者中miR-99a的表達量下降，幾乎與對照組的表達相同，在可評估的復發(fā)患者中(AML-M2)，miR-99a的表達水平再次升高。同時qRT-PCR技術(shù)還顯示miR-99a在所有兒童初發(fā)CML患者中顯著高表達，而在CR患者中表達量下降。這些結(jié)果高度提示miR-99a起原癌基因的作用，促進兒童AML和CML的發(fā)生和發(fā)展。
　　 (3)miR-99a通過調(diào)控靶基因CTDSPL和TRIB2發(fā)揮原癌基因功

7、能。為研究miR-99a的功能，構(gòu)建了miR-99a的載體，再通過生物信息學方法，運用TargetScan(http∶//www.targetscan.org/)和PICTAR(pictar.mdc-berlin.de/)生物學軟件對miR-99a的靶基因進行正向和反向預測，并結(jié)合文獻檢索，預測出可能與白血病細胞分化與凋亡相關(guān)的5個靶基因：TRIB2、CTDSPL、Hoxal、RAC-1、MCL-1。并構(gòu)建靶基因載體，在293T細胞中通

8、過雙熒光報告Lipo轉(zhuǎn)染實驗先后篩選并初步證實其中的兩個抑癌基因CTDSPL和TRIB2是miR-99a靶基因。然后再選擇其中的CTDSPL進行驗證，在K562細胞(CML細胞系)中通過雙熒光報告電轉(zhuǎn)染實驗，結(jié)果與雙熒光報告Lipo轉(zhuǎn)染實驗相符。
　　 (4)對36例兒童AML和3例對照組樣本進行Western blot分析，結(jié)果表明在對照組和58％的CR患者中CTDSPL蛋白表達較高，而在復發(fā)和53％的初發(fā)AML患者中CTDS

9、PL蛋白表達較低，與miR-99a的表達呈相反趨勢。此外，用100nM miR-99a mimics轉(zhuǎn)染K562和HL60細胞后CTDSPL的表達明顯降低。進一步證實CTDSPL蛋白的表達受miR-99a調(diào)控，抑癌基因CTDSPL是miR-99a的靶標之一，大部分患者的發(fā)病可能與之有關(guān)。
　　 (5)MTT實驗表明miR-99a明顯促進K562和HL60細胞的增殖。雙染凋亡實驗也提示miR-99a抑制K562和HL60細胞的凋亡

10、。這些結(jié)果再次有力揭示miR-99a在兒童AML和CML中起著原癌基因的作用，促進兒童AML和CML的發(fā)生和發(fā)展。
　　 綜上所述，通過研究miR-99a與兒童AML和CML的關(guān)系，首次證實了miR-99a在兒童AML和CML中起著原癌基因的作用，抑癌基因CTDSPL和TRIB2是受其調(diào)控的其中兩個靶基因。該研究從基因調(diào)控水平揭示了兒童AML和CML的其中一個新致病機制，為將來開展以miRNA作為藥靶治療白血病的可能性增加了新的