慢性髓細胞白血病、星形細胞瘤的克隆演化研究.pdf

1、目前，隨著研究的深入，我們對腫瘤的生物學(xué)和基因組學(xué)的認識也有了改變。要將腫瘤的基因組學(xué)研究轉(zhuǎn)化到腫瘤的臨床治療，需要考慮到腫瘤細胞的復(fù)雜性以及其動態(tài)的演化特征。腫瘤演化過程中不同的腫瘤細胞克隆競爭空間和資源，最終具有生長優(yōu)勢的克隆形成新的腫瘤亞群。腫瘤以不同的時間和速度演化進展，在任何一個患者中其克隆結(jié)構(gòu)、基因型和表型都隨著時間改變。腫瘤克隆演化的研究除了使我們對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有更全面的了解，同時也有著重要的應(yīng)用價值，比如發(fā)現(xiàn)對治療更有

2、預(yù)測價值的標(biāo)志以提高個體化治療效果、以及阻止腫瘤對藥物的治療抵抗。而腫瘤克隆演化的特征，如克隆結(jié)構(gòu)或驅(qū)動突變等，或可以用于腫瘤預(yù)后的判定。
　　慢性髓細胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是一種骨髓細胞增殖異常的血液疾病。該疾病存在特征性的9號和22號染色體的易位t（9；22)（q34；q11），即費城染色體（Philadelphia chromosome，Ph），在分子水平上形成BCR/ABL1融

3、合基因。該融合基因編碼的蛋白具有酪氨酸激酶活性，在無生長因子的情況下能夠促使細胞增殖。Ph染色體是造成CML腫瘤表型的主要染色體畸變，幾乎所有的CML均存在BCR/ABL1融合基因。針對BCR/ABL1的靶向治療能夠使的CML患者緩解，但是Ph染色體的形成機制以及靶向治療后Ph染色體克隆演化還不是很清楚。
　　膠質(zhì)瘤（glioma）是一類起源于膠質(zhì)細胞的腫瘤，星形細胞瘤（astrocytoma）是最常見的神經(jīng)上皮性腫瘤。低級別的星

4、形細胞瘤一般生長緩慢，但是經(jīng)過一段時間會進展為高級別的惡性腫瘤，引起腫瘤的復(fù)發(fā)從而降低整體生存率。星形細胞瘤手術(shù)切除后極易復(fù)發(fā)，且惡性程度增高，但復(fù)發(fā)和惡性程度增高的機制尚不明確。大多數(shù)星形細胞瘤患者死于腫瘤的復(fù)發(fā)和惡變，研究其細胞遺傳水平的克隆演化對認識星形細胞瘤的生物學(xué)行為、進行針對性的治療有重要意義。
　　目的：
　　腫瘤的克隆演化是腫瘤的一個重要特征。為了研究克隆演化對于疾病的進展以及治療的影響，本研究選取了兩個腫瘤

5、類型：慢性髓細胞白血病和星形細胞瘤。前者存在特征性的染色體異常即費城染色體；后者的疾病特征為手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)惡變。通過全基因組的測序，一是研究CML中BCR/ABL1融合基因的形成機制以及針對Ph靶向治療后的克隆演化；二是通過研究星形細胞瘤的克隆演化，探尋影響該腫瘤復(fù)發(fā)惡變的分子遺傳因素。
　　方法：
　　本研究選取了一例CML患者，該患者確診CML后清除其自身骨髓行全相合異體造血干細胞移植（hematopoietic st

6、em cell transplantation，HSCT）（供體為患者姐姐），疾病進入 Ph（-）慢性期；后患者發(fā)生急淋變，熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）實驗顯示BCR/ABL1（+）；對患者進行針對Ph染色體的靶向治療后疾病得以緩解，Ph染色體消失。本研究收集了該患者姊妹間全相合異體造血干細胞移植后慢性期（Ph-）、急變期（Ph+）以及針對Ph靶向治療后再緩解期的骨髓組織

7、活檢樣本，并獲得患者的皮膚活檢組織作為正常對照。
　　本研究選取一例星形細胞瘤患者，該患者初診時腫瘤組織病理檢測顯示右側(cè)額葉星形細胞瘤（WHO II級），后患者腫瘤復(fù)發(fā)，組織病理檢測顯示右額葉膠質(zhì)母細胞瘤合并局灶間變型星形細胞瘤（WHO IV級）。收集患者初診腫瘤組織樣本（星形細胞瘤WHO II級）以及復(fù)發(fā)后腫瘤組織樣本（WHO IV級），并收集患者的外周血樣品作為正常對照。
　　對CML患者的骨髓組織皮膚組織的DNA和星形

8、細胞瘤患者的腫瘤組織和外周血DNA進行全基因重測序（測序深度≥50×）。首先將測序數(shù)據(jù)利用BWA軟件對比到參考基因組（UCSC hg19）上，應(yīng)用samtools、control-FREEC、muTect、Strelka、crest軟件分析樣品存在的遺傳學(xué)改變，包括點突變、拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）、插入/缺失（insertion-deletion，INDEL）和染色體易位；并與對照比較，基于腫瘤樣

9、本的體細胞單位點突變和拷貝數(shù)的位點集合，應(yīng)用ExPANdS軟件分析腫瘤樣品存在的亞克隆結(jié)構(gòu)，包括亞克隆的數(shù)目、亞克隆大小以及每個亞克隆中包含的突變。應(yīng)用 SciClone軟件對成對樣本進行亞克隆分析。
　　結(jié)果：
　　本研究選取的CML患者，在行姊妹間全相合異體骨髓移植后疾病進入慢性期（Ph-），后發(fā)生急變（Ph+），針對Ph靶向藥物治療后疾病再緩解。分析測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)骨髓樣品中存在一系列的SNPs、INDEL、CNVs和SV

10、s，急變期（Ph+）比慢性期（Ph-）出現(xiàn)更多的遺傳學(xué)異常，經(jīng)分析，急變期費城染色體的出現(xiàn)來源于患者本身（骨髓受體）。在靶向治療后一些急變期特有的遺傳異常隨著 Ph染色體的消失而消失；患者Ph（+）的急變期和皮膚組織樣本中獨有DNA修復(fù)基因BRIP1框移缺失突變；供體骨髓和患者的骨髓樣本共同存在BCR基因上的一些插入/缺失，僅患者 Ph（+）的急變期存在 BCR形成融合基因的斷裂點。ExPANdS軟件在Ph（+）急變期和Ph（-）緩解期

11、均有8個亞克隆結(jié)構(gòu)，克隆進化的發(fā)生圖均為“樹狀”結(jié)構(gòu)。
　　本研究中選取的星形細胞瘤患者，初診時為星形細胞瘤WHO II級，復(fù)發(fā)時為膠質(zhì)母細胞瘤合并局灶間變型星形細胞瘤WHO IV級。對其腫瘤組織DNA進行測序、數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)初診和復(fù)發(fā)階段腫瘤均存在基因NOTCH和ATRX的錯義突變；初診時存在基因TP53的雜合終止突變，復(fù)發(fā)時存在基因TP53的純合終止突變以及基因 IDH1的雜合錯義突變；同時復(fù)發(fā)腫瘤中有較多的染色體易位。ExP

12、ANdS軟件分析顯示，在初診和復(fù)發(fā)階段腫瘤分別有4和3個亞克隆結(jié)構(gòu)，初診階段的克隆進化的發(fā)生圖為“樹狀”結(jié)構(gòu)，而復(fù)發(fā)階段克隆進化的發(fā)生圖為“并行”結(jié)構(gòu)，提示該階段腫瘤克隆存在較高的異質(zhì)性。
　　結(jié)論：
　　在該CML患者復(fù)發(fā)、靶向治療的疾病進展過程中，BCR/ABL1融合基因為特征性的克隆改變，隨著其產(chǎn)生而出現(xiàn)一些列繼發(fā)性的突變或者染色體畸變，針對其靶向治療后以一些急變期特有的遺傳學(xué)異常隨著 Ph染色體的消失而消失；基因BC

13、R存在微缺失/突變的前提下，BRIP1等DNA修復(fù)基因的異常最終導(dǎo)致BCR/ABL1融合基因的形成。
　　對于星形細胞瘤，特異性的突變可用于腫瘤分子分型的依據(jù)，但IDH1與星形細胞瘤預(yù)后的關(guān)系值得進一步探討；腫瘤組織亞克隆結(jié)構(gòu)的分析可以為腫瘤的臨床預(yù)后判斷和靶向治療提供分子遺傳學(xué)依據(jù)；放療、化療可能對腫瘤克隆演化產(chǎn)生選擇壓力，從而使TP53突變的克隆產(chǎn)生選擇優(yōu)勢。星形細胞瘤復(fù)發(fā)階段克隆的異質(zhì)性增強，研究結(jié)果提示初次手術(shù)后的放療要慎