SNS-032抗急性髓細(xì)胞白血病作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:SNS-032抑制AML細(xì)胞的生長并下調(diào)mTORC1/mTORC2蛋白及其上下游靶蛋白
　　 目的:研究和比較SNS-032對(duì)AML來源的血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞株的生長抑制作用及誘導(dǎo)凋亡情況，并初步探索SNS-032抗AML的凋亡分子機(jī)制。
　　 方法:MTT法檢測(cè)SNS-032作用AML細(xì)胞株和原代標(biāo)本的生長抑制作用，集落培養(yǎng)法觀察SNS-032處理后AML細(xì)胞株，原代AML細(xì)胞及正常骨髓細(xì)胞克隆情況，hoec

2、hst染色法、AV/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SNS-032處理后AML細(xì)胞凋亡情況，Real-Time PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平以及western blot法檢測(cè)SNS-032作用后caspase-3、caspase-9和PARP蛋白的表達(dá)變化，Western-blot法檢測(cè)AML關(guān)系密切的PI3K/Akt/mTOR通路，STAT3/STAT5通路，ERK/MAPK通路蛋白變化，并與其他抑制劑比較。ELISA方法檢測(cè)SNS-032處理后

3、mTOR蛋白的變化。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)處理軟件分析，以p＜0.05作為有差別統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:(1).0～200nmol/L的SNS-032作用7種AML細(xì)胞株24小時(shí)后IC50介于71.7-402 nM之間，而HEL細(xì)胞對(duì)SNS-032耐藥，其IC50＞3000nM;(2).SNS-032處理原代細(xì)胞48小時(shí)后，大部分的AML原代細(xì)胞對(duì)SNS-032敏感(85.1％)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其敏感性與FAB分型等其他

4、因素?zé)o關(guān);(3).SNS-032處理七天后，大部分的細(xì)胞株和原代細(xì)胞幾乎無集落形成，而正常細(xì)胞的集落形成影響不大;(4).SNS-032能明顯誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)能下調(diào)xIAP, c-IAP1，Mcl-1，c-MYC的mRNA和蛋白水平;(5).SNS-032能下調(diào)RNA PolyraseⅡ CTD的磷酸化水平，卻對(duì)其上游的Cdk2，Cdk7和Cdk9抑制作用不明顯;(6).SNS-032下調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路及其相

5、關(guān)蛋白，抑制mTORC1/mTORC2及其下游蛋白的表達(dá)，而對(duì)ERR/MAPK，STAT3/STAT5通路蛋白影響不大。另外SNS-032能部分下調(diào)p110δ和IGF-1R;(7).去除SNS-032后，mTOR的磷酸化蛋白能夠部分恢復(fù);(8).IGF-1能夠上調(diào)mTOR的磷酸化水平，卻不能逆轉(zhuǎn)SNS-032對(duì)AML細(xì)胞的殺傷作用和蛋白抑制作用;(9).Rapamycin能夠通過部分抑制mTOR及其下游蛋白而抑制細(xì)胞的生長，SNS-03

6、2和PP242較前者，不僅能抑制mTORC1/mTORC2的表達(dá)，而且下調(diào)其下游相關(guān)蛋白。
　　 第二部分:SNS-032協(xié)同Akt抑制劑Perifosine誘導(dǎo)AML死亡及其機(jī)制研究。
　　 目的:研究小分子抑制劑SNS-032誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生凋亡及其分子機(jī)制，且Perifosine增強(qiáng)SNS-032誘導(dǎo)的凋亡具有協(xié)同抗AML作用，并探討SNS-032聯(lián)合Perifosine協(xié)同抗AML的凋亡機(jī)制，以期為臨床白血病治

7、療提供新的方法和策略。
　　 方法:通過MTT法檢測(cè)生長抑制作用，集落培養(yǎng)法觀察細(xì)胞克隆情況，western blot法檢測(cè)Caspase3、PARP和PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)處理軟件分析，以p＜0.05作為有差別統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.MTT結(jié)果顯示低劑量的SNS-032和Akt抑制劑具有協(xié)同抑制AML作用2.集落培養(yǎng)進(jìn)一步證實(shí)了低劑量的SNS-032和Akt抑制

8、劑具有協(xié)同抑制AML作用;3.Akt靶向抑制劑Perifosine能夠增強(qiáng)SNS-032誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡;4.Perifosine能夠增強(qiáng)SNS-032對(duì)AKT/mTOR通路蛋白的抑制并協(xié)同靶向Akt磷酸化水平。
　　 結(jié)論:通過體內(nèi)一系列研究，小分子抑制劑SNS-032具有抗白血病作用;通過誘導(dǎo)凋亡起到抗AML作用，同時(shí)不僅能抑制RNA PolyraseⅡ CTD的p-Ser2和p-Ser5，而且能抑制mTORC1/mTOR