COH-2-3對急性前髓白血病HL60細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 研究5-(3-amino-4-methoxyphenyl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3H-1,2-dithiol-3-one(COH-2-3)對急性前髓白血病HL60細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制。
　　 方法
　　 一、MTT法
　　 應(yīng)用MTT方法檢測COH-2-3和順鉑對HL60細(xì)胞的生長抑制作用。取對數(shù)生長期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,以每孔1 ×103個細(xì)胞密度接種到

2、96孔板,每孔加200μL細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)分組:藥物處理組(藥物濃度分別為0.01,0.03,0.1,0.3,1.0,3.0μg/mL)；陰性對照組(只加培養(yǎng)細(xì)胞,不加藥)；空白對照組(只加培養(yǎng)基),每個組設(shè)6個復(fù)孔。將96孔板放在37℃含5％CO2的孵箱中培養(yǎng)44小時后,每個孔內(nèi)加入20μL的3-(4,5-dimethylthythiazol-2-y1)2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT)溶液繼續(xù)孵育

3、4小時后,吸出上清液每孔加150μL DMSO震蕩10分鐘后應(yīng)用酶標(biāo)儀測各孔吸光度(OD)值,本試驗(yàn)重復(fù)三次,按以下公式計(jì)算抑制率:抑制率=(1-給藥組平均OD值/對照組平均OD值)×100％。
　　 二、流式細(xì)胞術(shù)
　　 通過流式細(xì)胞術(shù)碘化丙錠(PI)單染檢測藥物COH-2-3對HL60細(xì)胞周期分布及凋亡的影響。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,以1×105個/mL的密度接種到培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)分組:藥物處理組(0.1,0.3,1.0μ

4、g/mLCOH-2-3處理24小時；1μg/mLCOH-2-3處理6,12,24小時),陰性對照組(只加培養(yǎng)細(xì)胞,不加藥)。收集細(xì)胞,用PBS洗兩遍,加入70％終濃度的酒精4℃固定過夜,20μg/mL的RNase37℃水浴箱中孵育30分鐘后,加入終濃度為50μg/mL的PI溶液4℃避光孵育30分鐘,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞各周期百分率和凋亡細(xì)胞百分率。
　　 三、吖啶橙(AO)/溴乙錠(EB)雙染色法
　　 通過吖啶橙(AO)

5、/溴乙錠(EB)雙染色法觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。取對數(shù)生長期細(xì)胞,以1×105個/mL的密度接種到培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)分組:藥物處理組(1μg/mLCOH-2-3 處理6,12,24小時),陰性對照組(只加培養(yǎng)細(xì)胞,不加藥)。收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/mL,取100μg/mL的AO/EB混合液1μL加到25μL的細(xì)胞懸液中吹打混勻,取一滴加到載玻片上蓋上蓋玻片,免疫熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　 四、免疫熒光

6、r>　　 通過免疫熒光技術(shù)觀察藥物處理組細(xì)胞的微管蛋白形態(tài)學(xué)變化。取對數(shù)生長期細(xì)胞,以1×105個/mL的密度接種到培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)分組:藥物處理組(1μg/mLCOH-2-3處理24小時),陰性對照組(只加培養(yǎng)細(xì)胞,不加藥)。4％多聚甲醛固定10分鐘,0.5％TritonX-100打孔30分鐘,5％牛血清白蛋白37℃水浴箱中封閉2小時,1:50 鼠抗β-tubulin單克隆抗體4℃孵育過夜,1:50抗鼠LgG抗體室溫避光孵育2小時,1

7、:100的Hoechst 33342染核10分鐘,50％甘油封片,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞微管形態(tài)變化。
　　 五、蛋白免疫印記(Westorn blot)法
　　 通過Western blot方法檢測藥物處理后細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)情況。取對數(shù)生長期細(xì)胞,以1×105個/mL的密度接種到培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)分組:藥物處理組(cyclin B,P34cdc2,caspase-3:0.1,0.3,1μg/mL COH-2-3處理24小時；

8、Bcl-2:1μg/mL COH-2-3處理24小時),陰性對照組(只加培養(yǎng)細(xì)胞,不加藥)。收集細(xì)胞,測蛋白濃度,蛋白定量,加樣,跑膠,轉(zhuǎn)印,封閉后,一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育2小時后ECL發(fā)光。以β-actin為內(nèi)對照,用凝膠成像分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值,并取其與β-actin的比值為相對表達(dá)量分析蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果
　　 通過MTT 檢測方法我們可以看出,COH-2-3與順鉑都能夠明顯的抑制HL60細(xì)胞

9、生長,但COH-2-3對細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于順鉑(IC50分別為:0.026±0.004、0.963±0.012),兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05；流式細(xì)胞術(shù)碘化丙啶PI單染結(jié)果表明,隨著藥物劑量的增加和藥物作用時間的延長,G2/M期細(xì)胞所占比率和凋亡細(xì)胞所占比率逐漸增加,較陰性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05；AO/EB雙染色法觀察到了凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)演變過程,從細(xì)胞核濃縮,核裂解到凋亡小體的形成；免疫熒光顯微鏡下觀察到

10、COH-2-3可抑制微管蛋白的聚合作用；Western blot結(jié)果表明COH-2-3使細(xì)胞內(nèi)周期相關(guān)蛋白cyclin B表達(dá)明顯增強(qiáng),較陰性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05；且使凋亡相關(guān)蛋白caspase-3被活化和抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào),較陰性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05。
　　 結(jié)論
　　 本研究結(jié)果表明,COH-2-3是通過阻滯HL60細(xì)胞在G2/M期并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)其抑制HL60細(xì)胞