白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)急性髄系白血病細(xì)胞HL-60-ADR耐藥機制的研究.pdf

1、第一部分白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)HL-60/ADR細(xì)胞耐藥的PI3K/Akt/Nrf2信號通路機制
　　目的：
　　探討急性髄系白血病細(xì)胞HL-60/ADR耐藥及白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)其耐藥的PI3K/Akt/Nrf2信號通路機制。
　　方法：
　　1實驗分為5組：①HL-60細(xì)胞未處理組(HL-60)；②HL-60/ADR耐藥細(xì)胞未處理組(HL-60/ADR)；③HL-60/ADR耐藥細(xì)胞經(jīng)阿霉素處理組(ADR)；④HL-60/AD

2、R耐藥細(xì)胞經(jīng)白藜蘆醇處理組(Res)；⑤HL-60/ADR耐藥細(xì)胞經(jīng)阿霉素和白藜蘆醇聯(lián)合處理組(ADR+Res)。
　　2采用CCK-8法測定不同濃度Res(25、50、100、200μmol/L)和不同濃度ADR(2、4、8、16μmol/L)以及Res(25μmol/L)聯(lián)合不同濃度ADR(2、4、8、16μmol/L)對HL-60/ADR耐藥細(xì)胞增殖抑制率的影響。
　　3采用流式細(xì)胞術(shù)檢測2μmol/L ADR和2μm

3、ol/L ADR+25μmol/L Res處理48h后HL-60/ADR耐藥細(xì)胞內(nèi)ADR的自發(fā)熒光強度。
　　4采用RT-PCR法檢測各實驗組中信號分子PI3K、Akt、Nrf2和耐藥蛋白MRP1的mRNA表達(dá)水平。
　　5采用Western-blot法檢測各實驗組中PI3K、磷酸化Akt(p-Akt)、Nrf2和MRP1的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1不同濃度Res(25、50、100、200μmol/L)

4、作用于HL-60/ADR耐藥細(xì)胞48h后，細(xì)胞的最大增殖抑制率分別為44％、61%、76%和81%，呈濃度依賴性(r=0.876, P<0.05)；ADR對HL-60敏感細(xì)胞和HL-60/ADR耐藥細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為：(0.147±0.015)μmol/L和(8.486±1.133)μmol/L；與ADR組的半數(shù)抑制濃度(IC50)(8.486±1.133μmol/L)相比， ADR+25μmol/L Res組HL-6

5、0/ADR耐藥細(xì)胞的IC50(1.869±0.239μmol/L)明顯減少(P<0.05)。
　　22μmol/L ADR聯(lián)合25μmol/L Res作用48h后，HL-60/ADR耐藥細(xì)胞內(nèi) ADR自發(fā)熒光強度(3953±50)較2μmol/L ADR處理組(1850±122)明顯增加(P<0.05)。
　　3 HL-60/ADR耐藥細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt、Nrf2和MRP1的mRNA表達(dá)水平顯著高于HL-60敏感細(xì)胞(P

6、<0.05)；25μmol/L Res和2μmol/L ADR+25μmol/L Res處理48h后，HL-60/ADR耐藥細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt、Nrf2和MRP1的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)。
　　4 HL-60/ADR耐藥細(xì)胞內(nèi)PI3K、p-Akt、Nrf2和MRP1的蛋白表達(dá)水平顯著高于HL-60敏感細(xì)胞(P<0.05)；25μmol/L Res和2μmol/L ADR+25μmol/L Res處理48h后

7、，HL-60/ADR耐藥細(xì)胞內(nèi)PI3K、p-Akt、Nrf2和MRP1的蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)。
　　第二部分白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)HL-60/ADR細(xì)胞耐藥的凋亡機制
　　目的：
　　探討急性髄系白血病細(xì)胞HL-60/ADR耐藥及白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)其耐藥的凋亡機制。
　　方法：
　　1實驗分為5組：①HL-60細(xì)胞未處理組(HL-60)；②HL-60/ADR耐藥細(xì)胞未處理組(HL-60/ADR)；③HL-

8、60/ADR耐藥細(xì)胞經(jīng)阿霉素處理組(ADR)；④HL-60/ADR耐藥細(xì)胞經(jīng)白藜蘆醇處理組(Res)；⑤HL-60/ADR耐藥細(xì)胞經(jīng)阿霉素和白藜蘆醇聯(lián)合處理組(ADR+Res)。
　　2采用流式細(xì)胞術(shù)檢測ADR、Res和ADR+Res處理HL-60/ADR耐藥細(xì)胞48h后的細(xì)胞凋亡率。
　　3采用 RT-PCR法檢測各實驗組中抗凋亡蛋白 Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的mRNA表達(dá)水平。
　　4采用Western-blo

9、t法檢測各實驗組中Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1 Res和ADR+Res處理48h后，HL-60/ADR耐藥細(xì)胞凋亡率分別為(33.9±3.6)%和(31.1±2.7)%，較 HL-60/ADR組(4.4±0.7)%均顯著增高(P<0.05)。
　　2 HL-60/ADR耐藥細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的mRNA表達(dá)水平顯著高于HL-60敏感細(xì)胞，Bax的mRNA表達(dá)水平顯著低于HL-60敏感細(xì)胞(P<0.

10、05)；Res和ADR+Res處理48h后，HL-60/ADR耐藥細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，Bax的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。
　　3 HL-60/ADR耐藥細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著高于HL-60敏感細(xì)胞，Bax的蛋白表達(dá)水平顯著低于HL-60敏感細(xì)胞(P<0.05)；Res和ADR+Res處理48h后，HL-60/ADR耐藥細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0