白藜蘆醇抗白血病效應(yīng)及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分白藜蘆醇抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及其機(jī)制 目的觀察白藜蘆醇(Res)對(duì)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響，為其作為抗白血病藥物的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法以人髓性白血病細(xì)胞系K562為研究對(duì)象，以含10％胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)基于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液傳代，實(shí)驗(yàn)選取細(xì)胞活性均在98％以上。采集正常健康成人外周靜脈血，以淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC

2、)，培養(yǎng)于上述培養(yǎng)基。MTT法檢測(cè)不同濃度Res作用于K562細(xì)胞、NPBMNC后細(xì)胞的增殖抑制率，并進(jìn)行比較。 Annein-V-FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)觀察不同濃度Res對(duì)K562細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果(1)細(xì)胞培養(yǎng)各組之間K562細(xì)胞抑制率與Res濃度及培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)性，一定濃度范圍內(nèi)Res對(duì)PBMNC無(wú)顯著抑制作用，表明Res抑制K562細(xì)胞增殖可能具有選擇性作用。(2)隨著Res濃度的增加，K5

3、62細(xì)胞周期發(fā)生變化，細(xì)胞周期被阻滯于S期，G2/M期細(xì)胞比例減少。(3)Res能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。 結(jié)論Res可顯著抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用呈濃度和時(shí)間依賴性；誘導(dǎo)白血病細(xì)胞周期停滯及凋亡是Res抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制；Res對(duì)正常人PBMNC生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，而選擇性作用于白血病細(xì)胞。 第二部分白藜蘆醇對(duì)白血病細(xì)胞RAS系統(tǒng)的影響及意義 目的觀察白血病患者體內(nèi)腎素水平的變化，同時(shí)在體外觀察血管緊

4、張素(AngⅡ)對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制作用，及Res對(duì)AngⅡ水平的影響。以期探討腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用及Res抗白血病的機(jī)制。 方法采集30例急慢性白血病患者骨髓和外周血，以7例血小板減少性紫癜患者作為正常對(duì)照，放免法檢測(cè)標(biāo)本中的腎素濃度。體外試驗(yàn)以人髓性白血病細(xì)胞系K562為研究對(duì)象，以含10％胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)基于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液傳代，實(shí)驗(yàn)選取細(xì)胞活性均在9

5、8％以上。MTT法檢測(cè)不同濃度AngⅡ作用于K562細(xì)胞后增殖抑制率。同樣采用上述培養(yǎng)的K562細(xì)胞，以100、200μmol·L-1濃度Res作用48小時(shí)后，放免法檢測(cè)兩種濃度Res對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AngⅡ含量的影響。 結(jié)果(1)急性白血病患者骨髓組織中腎素濃度顯著增高，與正常對(duì)照組相比有顯著性差異(P值均＜0.05)；而慢性髓細(xì)胞白血病患者骨髓組織中腎素濃度雖高于正常對(duì)照，但無(wú)顯著性差異(P=0.562)。8例急性白血病患

6、者同時(shí)檢測(cè)了骨髓和外周血中腎素水平，兩者相比有顯著性差異(P=0.043)。(2)AngⅡ?qū)562細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的效應(yīng)，在一定范圍內(nèi)與濃度時(shí)間成正比。(3)Res作用48小時(shí)后細(xì)胞上清液中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)含量明顯降低。 結(jié)論急性白血病患者骨髓局部存在RAS的異常；K562細(xì)胞系中存在AngⅡ的自分泌途徑，AngⅡ?qū)562細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用；Res可以劑量依賴方式抑制AngⅡ的生成，推測(cè)與Res具備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶

7、抑制劑(ACEI)的活性有關(guān)。提示Res有可能通過(guò)抑制AngⅡ的生成而抑制白血病細(xì)胞增殖。 第三部分白藜蘆醇對(duì)白血病血管新生的抑制作用及機(jī)制 目的體外研究Res對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用以及Res對(duì)白血病細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的影響。探討Res抗白血病血管新生的作用及機(jī)制。 方法以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和白血病U937細(xì)胞系為研究對(duì)象，分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。接種于預(yù)先包被1％明膠的25cm2塑料培養(yǎng)

8、瓶中，待其長(zhǎng)成完全融合狀單層細(xì)胞。Ⅷ因子SABC法鑒定其為內(nèi)皮細(xì)胞，取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用體外小管形成實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的Res對(duì)HUVEC微血管形成的影響。U937細(xì)胞培養(yǎng)方法同前一部分，用ELISA法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)U937細(xì)胞上清中VEGF水平的影響。 結(jié)果(1)當(dāng)接種在基質(zhì)膠上時(shí)，正常HUVECs可形成完整的管狀結(jié)構(gòu)，加入Res后產(chǎn)生劑量依賴的基質(zhì)膠誘導(dǎo)小管生成受抑。(2)Res作用于U937細(xì)胞24、48h后，細(xì)胞上清