白藜蘆醇抗心肌缺血再灌注損傷的線粒體機(jī)制研究.pdf

1、白藜蘆醇是一種生物活性多樣的多酚類化合物，主要存在于葡萄、花生、虎杖等食品和藥材中。白藜蘆醇具有良好的心血管保護(hù)、抗衰老、抗腫瘤等營(yíng)養(yǎng)保健作用，是分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)和藥理學(xué)熱門研究對(duì)象之一。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有顯著的抗心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不明確。線粒體為心肌中含量最豐富的細(xì)胞器，白藜蘆醇對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用，很有可能與線粒體相關(guān)。線粒體不僅為心肌提供能量，而且在維持細(xì)胞的Ca2+穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡或壞死等過(guò)程中

2、起著決定性作用，其功能障礙與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mitochondria permeability transition pore，mPTP)密切相關(guān)。mPTP的開(kāi)放是缺血再灌注損傷從可逆向不可逆過(guò)渡的一個(gè)關(guān)鍵因素。其中位于mPTP外膜上的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)控制著離子和代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)于mPTP的開(kāi)放和關(guān)閉起重要作用。故我們推測(cè)VDAC可能是白藜蘆醇的抗心肌

3、缺血再灌注保護(hù)作用的線粒體靶點(diǎn)。
　　 本課題采用H9c2心肌細(xì)胞株，利用基因克隆和RNA干擾(RNAi)技術(shù)，通過(guò)體外缺血再灌注損傷模型，即缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷模型，測(cè)定在VDAC1蛋白正常表達(dá)、低表達(dá)和高表達(dá)，以及細(xì)胞外液無(wú)Cl-等不同情況下，白藜蘆醇對(duì)心肌細(xì)胞、線粒體功能及線粒體介導(dǎo)的凋亡通路的作用。利用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)或線粒體內(nèi)Ca2+、活性氧(ROS)深度變化，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)Cl-濃度的變化，以進(jìn)一步闡明白

4、藜蘆醇對(duì)急性心肌損傷保護(hù)的分子生物學(xué)機(jī)制?，F(xiàn)將本論文主要研究結(jié)果歸納如下：
　　 1.探討了白藜蘆醇對(duì)H9c2心肌細(xì)胞A/R損傷保護(hù)作用的量效關(guān)系。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；按試劑盒說(shuō)明測(cè)定細(xì)胞內(nèi)LDH和CPK的活性、MDA含量以及抗氧化物酶SOD和GSH-Px的活性；流式細(xì)胞法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、ROS、線粒體膜電位及細(xì)胞凋亡；分光光度計(jì)法測(cè)定mPTP的開(kāi)放。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50μM的白藜蘆醇可發(fā)揮最佳心肌保護(hù)作用，降低LDH和

5、CPK活性，提高心肌細(xì)胞存活率，提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活性，減少ROS生成和MDA含量，防止鈣超載和mPTP開(kāi)放，維護(hù)線粒體膜電位，減少細(xì)胞凋亡。
　　 2.Western blot法檢測(cè)白藜蘆醇及A/R損傷對(duì)VDAC1表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A/R損傷可上調(diào)VDAC1的表達(dá)，而白藜蘆醇則可抑制VDAC1的表達(dá)。
　　 3.通過(guò)RNAi技術(shù)進(jìn)一步明確VDAC1在A/R損傷導(dǎo)致mPTP開(kāi)放中的意義。結(jié)果表明，RNAi

6、特異性沉默VDAC1后可顯著減輕A/R后的氧化應(yīng)激、鈣超載、維護(hù)線粒體膜電位，防止mPTP開(kāi)放，從而抑制細(xì)胞色素c(Cyt c)的釋放和caspase-3的激活，減少細(xì)胞凋亡。說(shuō)明VDAC1在A/R損傷引起mPTP開(kāi)放及線粒體凋亡通路激活中發(fā)揮著重要的作用。
　　 4.構(gòu)建VDAC1真核表達(dá)載體pFLAG-VDAC1，采用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)建立VDAC1蛋白高表達(dá)組，通過(guò)反向驗(yàn)證進(jìn)一步明確白藜蘆醇心肌保護(hù)作用與VDAC1的關(guān)系。結(jié)果表

7、明導(dǎo)入pFLAG-VDAC1后可取消白藜蘆醇的心肌保護(hù)作用，說(shuō)明白藜蘆醇的心肌保護(hù)作用就是由VDAC1介導(dǎo)的。
　　 5.深入探討VDAC1參與mPTP開(kāi)放的調(diào)節(jié)機(jī)制。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體內(nèi)Cl-濃度發(fā)現(xiàn)，A/R損傷時(shí)線粒體內(nèi)Cl-濃度明顯升高，而利用RNAi下調(diào)VDAC1水平則可減少線粒體內(nèi)Cl-濃度，并且白藜蘆醇預(yù)處理或去除細(xì)胞外Cl-也可有效降低線粒體內(nèi)Cl-濃度，導(dǎo)致Ca2+濃度下降，ROS生成減少，防止mPTP開(kāi)放

8、。此結(jié)果說(shuō)明VDAC1就是Cl-進(jìn)出線粒體的主要通道，并且Cl-在mPTP開(kāi)放調(diào)節(jié)和VDAC介導(dǎo)的白藜蘆醇抗急性心肌保護(hù)作用及線粒體功能維護(hù)中發(fā)揮著重要的作用。
　　 上述結(jié)果表明：白藜蘆醇通過(guò)抑制A/R損傷時(shí)VDAC1的表達(dá)，減少Cl-進(jìn)入線粒體，取消”氯增加誘發(fā)鈣小體釋放機(jī)制”的觸發(fā)作用，從而減輕Ca2+超載和氧化應(yīng)激，防止mPTP開(kāi)放，維持線粒體膜電位，抑制Cyt c的釋放及caspase-3的活性，最終顯著減少細(xì)胞凋亡。