白藜蘆醇對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷不同階段的保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、腦缺血性疾病是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病變，可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙并威脅人類的健康和生命。工業(yè)化國(guó)家每10萬(wàn)人中有250～400人發(fā)生腦缺血，死亡率約為30％，屬于人類死亡的第三大原因。因此，研究腦組織缺血后再灌注過(guò)程的分子機(jī)制和治療方法成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的熱點(diǎn)課題。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）化學(xué)名稱為3，5，4-三羥基苯二烯，是一種廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物性食物或藥物中的多酚類活性單體。自1940年人們首次從毛葉藜蘆的根部分

2、離獲得Res以來(lái)，陸續(xù)開(kāi)展了對(duì)其藥理活性的探討，結(jié)果表明Res具有抗癌、抗炎、抗氧化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及雌激素調(diào)節(jié)等多方面藥理活性。近年來(lái)大量實(shí)驗(yàn)表明，Res對(duì)抗缺血性損傷具有潛在的作用。本研究應(yīng)用小鼠腦缺血再灌注模型，進(jìn)一步探討了Res對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷急性期和恢復(fù)期的保護(hù)作用，并且分別從蛋白、基因水平研究了Res與恢復(fù)期腦缺血再灌注損傷發(fā)生密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的關(guān)系。旨在進(jìn)一步探討Res對(duì)腦缺血再灌注損傷的

3、保護(hù)作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用Res治療腦缺血性疾病奠定理論基礎(chǔ)。
　　一、Res對(duì)小鼠局灶性缺血再灌注后急性期的影響
　　目的：證實(shí)Res對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討其與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α的關(guān)系。
　　方法：選用健康雄性Balb/c小鼠，隨機(jī)分為單純?nèi)毖M、Res組及菲諾貝特組。采用插線法建立暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模

4、型，MCAO時(shí)間為120min。于手術(shù)后24h分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。腦組織切片行HE染色，光鏡觀察缺血區(qū)域及其周圍細(xì)胞形態(tài)特征。并獲取完整端腦，切成2mm冠狀厚片，2％紅四氮唑(TTC)染色，計(jì)算梗塞體積和水腫程度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Evans blue染色觀察血腦屏障破壞程度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；另外，提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：Res和菲諾貝特能夠減少腦

5、梗塞體積（43.80±5.31mm3、45.57±5.63mm3VS63.87±9.33mm3，P<0.01），減少Evansblue外滲的體積（58.66±4.65mm3、78.72±5.78mm3VS102.06±6.07mm3，P<0.01）和含量(6.40±0.92ug/g、12.47±1.24ug/gVS15.25±1.51ug/g，P<0.01)，增強(qiáng)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α的表達(dá)[(0.893±0.028)、(1.11

6、7±0.042)VS（0.467±0.013），P<0.01]。
　　結(jié)論：Res對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，減輕了血腦屏障的破壞和腦梗塞的程度,這可能得益于其誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α表達(dá)增高，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷急性期起到保護(hù)作用。
　　二、Res對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷恢復(fù)期的保護(hù)作用
　　目的：證實(shí)Res對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后恢復(fù)期的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討其與缺血腦組織內(nèi)基質(zhì)金屬

7、蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase 2,MMP-2）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的關(guān)系。
　　方法：選用健康雄性Balb/c小鼠，采用插線法建立暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型，MCAO時(shí)間為120min。隨機(jī)分為5組：對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于MCAO前5min接受相應(yīng)體

8、積的20％環(huán)糊精/0.9％NaCL強(qiáng)飼，每天1次，直至第7d；缺血組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于MCAO前5min接受Res強(qiáng)飼（溶于20％環(huán)糊精/0.9％NaCL），50mg/kg，每天1次，直至第7d；再灌注組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于再灌注前5min接受Res強(qiáng)飼（溶于20％環(huán)糊精/0.9％NaCL），50mg/kg，每天1次，直至第7d；一天組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于再灌注后24h接受Res強(qiáng)飼（溶于20％環(huán)糊精/0.9％NaCL），50mg/kg，每天1次，直至第7d

9、；三天組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于再灌注后72h接受Res強(qiáng)飼（溶于20％環(huán)糊精/0.9％NaCL），50mg/kg，每天1次，直至第7d；于手術(shù)后第7d分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。獲取完整端腦，切成2mm冠狀厚片，2％紅四氮唑(TTC)染色，計(jì)算梗塞體積和水腫程度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)腦組織冠狀切片進(jìn)行CD34染色并統(tǒng)計(jì)微血管數(shù)量。另外，提取總蛋白或總RNA，采用Western Blot和RT-PCR技術(shù)分別從蛋白和基因水平

10、檢測(cè)VEGF和MMP-2的表達(dá)。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，缺血組和再灌注組的神經(jīng)功能評(píng)分和梗塞體積明顯降低(P<0.05)；缺血組、再灌注組和一天組皮層區(qū)域的微血管減少的數(shù)目與對(duì)照組相比較有明顯差異(P<0.05)；缺血組和再灌注組VEGF和MMP-2的蛋白和基因表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　結(jié)論：Res對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷恢復(fù)期具有明顯的保護(hù)作用，這可能得益于其在缺血再灌注損傷后的早期應(yīng)用，促進(jìn)了血管形成