解毒化瘀方逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥株HL60-VCR耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)用解毒化瘀方（山慈菇、青黛、虎杖、蚤休、莪術(shù)、丹參、川芎、補(bǔ)骨脂）制備成含藥兔血清后，對(duì)白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR進(jìn)行處理。通過(guò)觀察白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中多藥耐藥基因P-gp及凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，探討解毒化瘀方對(duì)白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR多藥耐藥現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)機(jī)制。
　　方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng):分別將白血病細(xì)胞株HL60及白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR接種于含10％胎牛血清的RPMI164

2、0培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，2-3天傳代一次，更換細(xì)胞液。
　　(2)用MTT法分別檢測(cè)長(zhǎng)春新堿VCR對(duì)自血病細(xì)胞株HL60和白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR這兩種細(xì)胞的殺傷毒性，從而計(jì)算出白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR的耐藥倍數(shù)。
　　(3)用免疫組化法對(duì)解毒化瘀方含藥兔血清處理的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR進(jìn)行蘇木伊紅染色后，觀察其顯色，判斷白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中多藥耐藥

3、基因P-gp的表達(dá)。
　　(4)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)解毒化瘀方含藥兔血清處理的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR進(jìn)行熒光標(biāo)記檢測(cè)，觀察結(jié)果判斷白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR耐藥倍數(shù):在白血病細(xì)胞株HL60、白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR的培養(yǎng)液中分別加入2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L濃度梯度的長(zhǎng)春新堿培養(yǎng)72小時(shí)后，自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)

4、白血病細(xì)胞株HL60的IC50濃度OD值為33.127umol/L，而白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR的IC50濃度OD值為149.001umol/L，求得白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR的耐藥倍數(shù)為4.5倍。
　　(2)用免疫組化法蘇木伊紅染色經(jīng)解毒化瘀方含藥兔血清處理的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR進(jìn)行檢測(cè)，多藥耐藥基因P-gp在白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中的表達(dá):經(jīng)免疫組化蘇木伊紅染色后的白血病細(xì)胞株HL60著色較淺

5、。而未加藥的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR著色較深，呈玫瑰紅色。干擾素處理的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR著色變淺，干擾素加解毒化瘀方含藥血清處理的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR著色較干擾素處理的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR著色更淺。低中高三個(gè)劑量組解毒化瘀方含藥兔血清分別單獨(dú)作用于白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR后，其著色均有不同程度的變淺，且劑量越大顏色越淺，低劑量著色相對(duì)最深，高劑量著色相對(duì)最淺，說(shuō)明低劑量組的多藥耐藥基

6、因P-gp的表達(dá)相對(duì)最高，高劑量相對(duì)最低。因此解毒化瘀方含藥兔血清能降低白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中的多藥耐藥基因P-gp的表達(dá)。
　　(3)用熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)對(duì)解毒化瘀方含藥兔血清處理的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR進(jìn)行檢測(cè)，凋亡抑制基因Bcl-2在白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中的表達(dá):經(jīng)熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)處理后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞株HL60中的凋亡抑制基因Bcl-2呈低表達(dá)。而未加藥的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/

7、VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)明顯偏高。干擾素處理的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)降低，干擾素加解毒化瘀方含藥血清處理的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)較干擾素處理的白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)更低。低中高三個(gè)劑量組解毒化瘀方含藥兔血清分別單獨(dú)作用于白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR后，其凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)均有不同程度的

8、降低，且劑量越大降低的越多，低劑量組表達(dá)相對(duì)最高，高劑量組相對(duì)最低，因此解毒化瘀方含藥兔血清能降低白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，且可能與劑量呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:(1)解毒化瘀方含藥兔血清能夠降低多藥耐藥基因P-gp在白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中的表達(dá)。
　　(2)解毒化瘀方含藥兔血清能夠降低凋亡抑制基因Bcl-2在白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR中的表達(dá)。
　　(3)解毒化瘀方