VEGF反義核酸對多藥耐藥細(xì)胞HL60-VCR耐藥性逆轉(zhuǎn)的實驗研究.pdf

1、多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是小兒白血病治療失敗、疾病復(fù)發(fā)的一個重要原因之一。其產(chǎn)生是多因素、多機制綜合作用的結(jié)果。關(guān)于多藥耐藥的研究，既往大多著眼于腫瘤細(xì)胞本身的生物異質(zhì)性，而往往忽略了宿主因素，尤其是細(xì)胞所處的造血微環(huán)境的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，造血微環(huán)境提供了細(xì)胞生存、增殖的土壤，細(xì)胞外基質(zhì)及其分泌的多種細(xì)胞因子的作用日益受到重視。造血微環(huán)境可形成內(nèi)穩(wěn)態(tài)，通過多種途徑影響著血液腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，

2、包括耐藥表型。深入研究造血微環(huán)境，將為多藥耐藥和微小殘留病變的治療提供新的靶點。針對造血微環(huán)境所表達的特殊蛋白的治療，對正常組織的影響小，同時對于轉(zhuǎn)移灶和微小殘留病變的針對性強，有望成為克服難治性血液腫瘤多藥耐藥的一種有效途徑。 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種具有肝素結(jié)合活性的生長因子，通過自分泌和旁分泌的方式作用于白血病細(xì)胞和微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞，不僅在血

3、管生成中起調(diào)節(jié)作用，而且在細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮了重要作用。一方面，VEGF以旁分泌的形式調(diào)節(jié)白血病的血管生成，還通過血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌途徑產(chǎn)生G-CSF、GM-CSF、IL-6和SCF促進白血病細(xì)胞的增殖。另一方面，白血病細(xì)胞分泌的VEGF作用于本身，維持自身存活、增殖、阻止白血病細(xì)胞凋亡，增強白血病細(xì)胞對放化療的抵抗作用，并引起細(xì)胞遷移。 目前，以VEGF及其受體為靶點的研究中，反義核酸是一種較有前景的方法。它不僅直接特異的封閉

4、基因表達，而且少有毒副作用。因此本研究選擇白血病細(xì)胞VEGF自分泌和旁分泌環(huán)的共同上游，阻斷VEGF的自身分泌，觀察白血病和耐藥白血病細(xì)胞的生物學(xué)行為(細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，相關(guān)基因表達，耐藥白血病細(xì)胞的致瘤性)的改變。探討VEGF在逆轉(zhuǎn)白血病耐藥中發(fā)揮的作用及機制，為臨床耐藥白血病的治療提供一條新的選擇途徑。 研究內(nèi)容： 1.建立VEGF反義核酸真核表達體系，為VEGF反義核酸的體內(nèi)和體外研究建立方法學(xué)基礎(chǔ)。 2

5、.研究VEGF反義核酸對白血病細(xì)胞和耐藥白血病細(xì)胞生長的影響。 3.研究VEGF反義核酸對耐藥白血病細(xì)胞對化療藥物敏感性的影響。 4.建立白血病多藥耐藥動物模型。 5.研究VEGF瘤體原位注射及與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對荷瘤鼠生存的影響。 研究方法： 1.構(gòu)建VEGF反義核酸真核表達載體從K562細(xì)胞中抽提RNA，RT-PCR方法擴增VEGF121片段，雙酶切空白質(zhì)粒載體pcDNA3-3.1和VEGF1

6、21片段后，利用設(shè)計好的酶切位點將VEGF121片段反向插入質(zhì)粒pcDNA3-3.1，得到VEGF反義核酸表達質(zhì)粒AS-pcDNA3-3.1-VEGF，篩選并鑒定陽性質(zhì)粒，擴增質(zhì)粒。 2.VEGF反義核酸對白血病細(xì)胞生長的影響通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將VEGF反義核酸真核表達載體AS-pcDNA3-3.1-VEGF轉(zhuǎn)染到HL60和HL60/VCR細(xì)胞，觀察不同細(xì)胞生長抑制情況，ELISA方法檢測培養(yǎng)細(xì)胞VEGF表達，RT-PCR方法檢

7、測耐藥相關(guān)基因表達，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化，WESTERNBLOT檢測P-gp蛋白表達。 3.VEGF反義核酸聯(lián)合化療藥物對耐藥白血病細(xì)胞的影響采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將VEGF反義核酸載體AS-pcDNA3-3.1-VEGF轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞HL60/VCR，分別加入HT或DNR，觀察HL60/VCR對HT或DNR耐藥性的變化，ELISA方法檢測培養(yǎng)細(xì)胞VEGF表達，RT-PCR方法檢測耐藥相關(guān)基因表達，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡情況。

8、 4.建立多藥耐藥荷瘤鼠模型將HL60/VCR皮下接種BALB/c-nu/nu裸鼠，觀察腫瘤生長及轉(zhuǎn)移情況，建立多藥耐藥荷瘤鼠模型。 5.VEGF反義核酸治療耐藥白血病的研究將荷瘤鼠分為3組，VCR組，VCR+AS-pcDNA3-3.1-VEGF組，對照組。將AS-pcDNA3-3.1-VEGF腫瘤原位注射與VCR腹腔注射后，觀察各組裸鼠的生存情況，外周血數(shù)量和細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，病理切片觀察不同部位的腫瘤負(fù)荷，RT-PCR方法檢測不同部

9、位腫瘤組織VEGF、MDR1表達改變。 研究結(jié)果： 1.VEGF121擴增片段長度421bp，雙酶切和測序結(jié)果均證實質(zhì)粒AS-pcDNA3-3.1-VEGF含有反向插入的VEGF121。 2.1.25umol/mL AS-pcDNA3-3.1-VEGF 與脂質(zhì)體質(zhì)量比為3：1轉(zhuǎn)染HL60/VCR細(xì)胞72h時，轉(zhuǎn)染效率最高，熒光細(xì)胞達51±2.4％。 3.AS-pcDNA3-3.1-VEGF作用于HL60、

10、HL60/VCR細(xì)胞24h和48h后，HL60/VCR細(xì)胞VEGF表達量明顯高于HL60細(xì)胞。與對照組比較，轉(zhuǎn)染組VEGF表達量顯著降低(P＜0.05)。Bcl-2、Mcl-1和TopoⅡα在HL60和HL60/VCR細(xì)胞中表達量無明顯差異(P＞0.05)，而MDR1、MRP、GSTπ、ToPo Ⅱβ的表達量在HL60/VCR細(xì)胞組明顯高于HL60細(xì)胞組(P＜0.01)。HL60細(xì)胞幾乎不表達P-gP，HL60/VCR細(xì)胞P-gp表達量

11、24h明顯高于48h(P＜0.05)。各組細(xì)胞均未出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。 4.AS-pcDNA3-3.1-VEGF與HT或DNR聯(lián)合應(yīng)用能有效抑制HL60/VCR細(xì)胞存活，與對照組相比，IC50有顯著性差異(P＜0.01)，VEGF表達量顯著降低(P＜0.05)。Bcl-2、Mcl-1、TopoⅡα、MDR1、MRP、GSTπ、ToPoⅡβ表達量均顯著降低(P＜0.05)，P-gP表達量也顯著降低(P＜0.05)。與對照組比較，各組細(xì)胞

12、均出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，S-pcDNA3-3.1-VEGF+化療藥物組凋亡細(xì)胞顯著增多(P＜0.05)。 5.2.0×106 HL60/VCR細(xì)胞皮下接種BALB/c-nu/nu裸小鼠，15～20天成瘤，成瘤率為67.7％。 6.治療組裸鼠瘤體體積、體重、外周血白血病數(shù)量、MDR1基因表達量均無明顯差異(P＞0.05)。 研究結(jié)論： 1.選用真核表達質(zhì)粒pcDNA3-3.1為載體，將VEGF121反向插入，成功構(gòu)

13、建VEGF反義核酸真核表達載體AS-pcDNA3-3.1-VEGF并轉(zhuǎn)染HL60/VCR細(xì)胞，為研究VEGF反義核酸逆轉(zhuǎn)HL60/VCR細(xì)胞耐藥提供方法學(xué)基礎(chǔ)。 2.1.25umol/mLAS-pcDNA3-3.1-VEGF與脂質(zhì)體質(zhì)量比為3：1轉(zhuǎn)染HL60/VCR細(xì)胞72h，VEGF反義核酸對HL60/VCR的抑制作用最強。 3.VEGF反義核酸可有效抑制HL60/VCR細(xì)胞生長，下調(diào)VEGF蛋白和MDR1、MRP、G

14、STπ和ToPo Ⅱβ基因表達。 4.VEGF反義核酸抑制HL60/VCR細(xì)胞生長的機理是抑制細(xì)胞增殖，而不是促進細(xì)胞凋亡。 5.內(nèi)源性VEGF具有抑制耐藥白血病細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境和細(xì)胞膜相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白途徑，降低細(xì)胞解毒和降低自我修復(fù)能力來逆轉(zhuǎn)耐藥。 6.VEGF反義核酸可提高HL60/VCR細(xì)胞對DNR、HT的敏感性，促進化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 7.裸鼠接種HL60/VCR細(xì)胞，建立耐藥白血病細(xì)