siRNA逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的體內(nèi)外研究.pdf

1、背景與目的：惡性腫瘤產(chǎn)生的多藥耐(multidrug-resistance，MDR)已成為當(dāng)前影響腫瘤化學(xué)治療療效的主要障礙。多藥耐藥性是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時，對結(jié)構(gòu)和作用機制不同的多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉抗藥性，從而大大降低了抗腫瘤藥物的療效。MDR產(chǎn)生機制復(fù)雜，其中由MDR1基因編碼的P-gp(P-glycoprotein，P-gP)的過度表達是產(chǎn)生MDR的主要原因。RNAi (RNA interference，

2、RNAi)是近年來興起的一種基因技術(shù)，指在廣泛的生物范圍內(nèi)都存在的由dsRNA(double stranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)的同源基因表達受抑制的現(xiàn)象，使內(nèi)源性mRNA發(fā)生特異性降解，代替了傳統(tǒng)反義核酸進行轉(zhuǎn)錄后基因沉默。本研究探討體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)后對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251和裸鼠人肺癌移植瘤的多藥耐藥性的影響。 方法：在GeneBank中找出人多藥

3、耐藥基因的mRNA序列，利用Invitrogen公司的RNA在線工具，設(shè)計了2對靶向多藥耐藥基因(MDR1)的干擾序列MDR1siRNAs和1對非特異siRNA，并進行Blast比對排除同源性。利用化學(xué)合成法得到干擾序列，體外與陽離子脂質(zhì)體構(gòu)建轉(zhuǎn)染復(fù)合體，轉(zhuǎn)染至U251細胞株，然后在轉(zhuǎn)染后24 h和48 h采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)和Western blot檢測細胞中MDR1 m

4、RNA和P-gp蛋白的表達情況，為了檢測轉(zhuǎn)染后的細胞對化療藥物的耐藥情況，我們將轉(zhuǎn)染后的細胞與臨床常用的耐藥的化療藥物進行共培養(yǎng)，然后采用MTT法進行檢測，計算抑制率(inhibition rate，IR)=(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100％；為了進一步探討MDR1siRNA的體內(nèi)干擾效果，我們構(gòu)建了裸鼠人肺癌移植瘤模型，聯(lián)合運用活體電穿孔和瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)染技術(shù)，將MDRlsiRNA轉(zhuǎn)染入移植瘤內(nèi)，并設(shè)計了不同的轉(zhuǎn)染劑量組(0

5、.5nmol/150mm<'3>、1nmol/150mm<'3>、2nmol/150mm<'3>、3nmol/150mm<'3>)，在轉(zhuǎn)染后48 h提取瘤組織，RT-PCR和immunohistochemistry檢測腫瘤中MDR1 mRNA和P-gp的表達情況；為了進一步研究轉(zhuǎn)染MDR1siRNA后，腫瘤對化療藥物的耐藥情況，我們在轉(zhuǎn)染后48 h開始腹腔注射給予裸鼠抗腫瘤藥物長春瑞濱(Vinorelbine Bitartrate， N

6、VB)治療(5mg/kg/w)，轉(zhuǎn)染后每兩天測量一次腫瘤的長徑和短徑，根據(jù)公式V=лab<'2>/6計算腫瘤的體積，繪制出腫瘤的生長曲線，并在最后一次給藥后2天，處死裸鼠，取出瘤塊進行稱重，然后根據(jù)公式IR=(1-實驗組的平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％計算抑瘤率。 結(jié)果：細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染MDR1siRNA后，RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示MDR1 mRNA和P-gp的表達較未轉(zhuǎn)染組明顯下降，藥敏結(jié)果顯示細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染

7、MDR1siRNA后，逆轉(zhuǎn)了細胞對長春新堿(Vincristine，VCR)、卡莫斯汀(Becenun，BCNU)、司莫司汀(Me-CCN)的耐藥(IR>30％)，增強了細胞對紫杉醇(Pacilitaxel，PTX)、表柔比星(Epimbicin，EPI)的敏感性(IR>50％)；裸鼠人移植瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染MDR1 siRNA后，RT-PCR和immunohistochemistry結(jié)果顯示低劑量轉(zhuǎn)染時僅能輕度抑制腫瘤中MDR1mRNA和P-g

8、p的表達，隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加，抑制作用逐漸增強，至2nmol/150mm<'3>時，抑制作用達到最大，當(dāng)繼續(xù)增加劑量時，表達未見繼續(xù)降低，說明活體轉(zhuǎn)染MDR1siRNA后能有效抑制MDR1mRNA和P-gp的表達，且其抑制作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。同時瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染MDR1siRNA后給予NVB(5mg/kg/w，i.p.)，結(jié)果顯示腫瘤的生長顯著減慢，NVB的抑瘤率明顯提高，而對未轉(zhuǎn)染MDR1siRNA的腫瘤的生長沒有表現(xiàn)出明顯抑制，說明