白血病多藥耐藥性及其逆轉(zhuǎn)的研究.pdf

1、研究目的：1.了解P糖蛋白(Pgp)、多藥耐藥基因(mdr1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白基因(MRP)和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)是否為急性白血病臨床耐藥的預(yù)后因素。2.確定Pgp、mdr1、MRP和TopoⅡ診斷急性白血病臨床耐藥的準(zhǔn)確性。3.研究發(fā)夾狀小分子干擾RNA(hairpinsiRNA)對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02mdr1和GSTπ基因的表達(dá)和功能的影響。
　　研究方法：1.45例急性白血病患者用單抗UIC2標(biāo)

2、記的流式細(xì)胞儀法測(cè)定Pgp;用RT-PCR方法檢測(cè)其mdr1、MRP和TopoⅡ的表達(dá),用單因素和多因素Logstic回歸分析它們與白血病預(yù)后的關(guān)系。2.以臨床耐藥作為金標(biāo)準(zhǔn),用受試者工作特征(ROC)曲線(xiàn)下面積評(píng)價(jià)上述參數(shù)的準(zhǔn)確性;在ROC曲線(xiàn)上確定各種參數(shù)的最佳臨界點(diǎn);為了提高這些參數(shù)的診斷價(jià)值,采用平行試驗(yàn)和系列試驗(yàn)計(jì)算其診斷臨床耐藥的靈敏度(Se)和特異度(Sp)。3.根據(jù)mdr1mRNA第79-99和GSTπmRNA第308-

3、327核苷酸為作用靶點(diǎn),合成針對(duì)靶區(qū)域序列的發(fā)夾狀siRNA,克隆入pSilencer2.1-U6neo,克隆產(chǎn)物為pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ,轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞株。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)K562/A02mdr1和GSTπmRNA的表達(dá);用Westernblot和熒光免疫組化觀察Pgp和GSTπ蛋白的表達(dá);MTT法檢測(cè)阿霉素對(duì)K562/A02細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　研究結(jié)果:1.耐藥

4、組Pgp、mdr1、MRP陽(yáng)性率均高于敏感組(P<0.01),而TopoⅡ耐藥組較低(P=0.049)。經(jīng)單因素Logistic回歸分析,Pgp、mdr1、MRP的過(guò)度表達(dá),TopoⅡ的表達(dá)降低和55歲以上年齡組與臨床耐藥性顯著相關(guān);性別、發(fā)病時(shí)WBC、FAB亞型和骨髓原+(早)幼細(xì)胞比例與耐藥性無(wú)關(guān)。多因素Logistic回歸分析經(jīng)以上變量校正后顯示Pgp、mdr1、MRP、TopoⅡ和年齡仍與耐藥性顯著相關(guān):Pgp(RR=14.87

5、,P=0.003);mdr1(RR=19.98,P=0.003);MRP(RR=16.53,P=0.006);TopoⅡ(RR=0.23,P=0.046);年齡(RR=10.87,P=0.013)。將36例初發(fā)急性白血病患者單獨(dú)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pgp、mdr1和MRP亦與完全緩解密切相關(guān)。Pgp(RR=9.8,P=0.005);mdr1(RR=12.1,P=0.005);MRP(RR=33,P=0.002)。直線(xiàn)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)在所有病例組和

6、臨床耐藥組中Pgp和mdr1;Pgp和MRP:mdr1和MRP具有相關(guān)性(P<0.001)。2.ROC曲線(xiàn)下面積(AUCROC):TopoⅡ明顯低于Pgp、mdr1和MRP(P<0.05),而Pgp、mdr1和MRP的ROC曲線(xiàn)下面積差別無(wú)顯著意義(P>0.05);Pgp、mdr1、MRP和TopoⅡ的最佳臨界點(diǎn)分別為10％、0.8、1.0和0.9,在對(duì)應(yīng)的靈敏度中,Pgp最高為74%,特異度中mdr1最高為86%;Pgp、mdr1和M

7、RP的平行試驗(yàn)和系列試驗(yàn)計(jì)算,靈敏度和特異度均可提高至91%。3.經(jīng)pSilence-mdr1轉(zhuǎn)染后的K562/A02細(xì)胞株mdr1mRNA表達(dá)量下降了71.5%,從(2.8±1.65)×108拷貝/μgRNA下降至(3.9±2.37)×107拷貝/μgRNA,(P<0.01);同時(shí)pSilence-GSTπ作用后,K562/A02GSTπmRNA表達(dá)量較mock下降了39.8%,從(2.3±1.14)×105拷貝/μgRNA下降至(5

8、.4±2.45)×104拷貝/μgRNA(P<0.01)。4.Westernblot結(jié)果顯示pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ分別轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞株后與mock相比,Pgp和GSTπ的表達(dá)明顯下降;而pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ對(duì)α-tubulin的表達(dá)沒(méi)有影響;K562/A02細(xì)胞株轉(zhuǎn)染pSilence-laminA/C后與mock相比,laminA/C的表達(dá)明顯下降,但對(duì)Pgp和

9、GSTπ的表達(dá)沒(méi)有作用;灰度掃描顯示與內(nèi)對(duì)照B-actin的比值,Pgp的表達(dá)量從K562/A02(mock)的0.75±0.019下降到K562/A02(pSilence-mdr1)的0.48±0.049(P<0.001);GSTπ的表達(dá)量從K562/A02(mock)的0.54±0.025下降到K562/A02(pSilence-GSTπ)的0.39±0.022(P<0.01)。熒光免疫組化結(jié)果顯示熒光顯微鏡下可見(jiàn)Pgp在K562/

10、A02組有大點(diǎn)狀的綠色熒光,陽(yáng)性細(xì)胞比例從轉(zhuǎn)染前的71.25±9.65%到pSilence-mdr1轉(zhuǎn)染后的35.25±5.97%(P<0.001);GSTπ在K562/A02組有多量點(diǎn)狀的紅色熒光,陽(yáng)性細(xì)胞從轉(zhuǎn)染前的81.25±6.49%下降到pSilence-GSTπ轉(zhuǎn)染后的41.25±4.43%(P<0.001)。5.MTT結(jié)果示對(duì)阿霉素的耐藥指數(shù)從空載體轉(zhuǎn)染后的23,到pSilence-mdr1轉(zhuǎn)染后的8和pSilence-GS