鹽霉素逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞SGC-7901-VCR多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 胃癌是世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，特別是在我國(guó)，胃癌的發(fā)病率僅次于肺癌，位居惡性腫瘤致死率的第二位。目前，胃癌的治療以手術(shù)、化療、放療等綜合治療為主。對(duì)于中晚期胃癌患者，由于已失去手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，化療則是最佳選擇。但是隨著化療周期的增加，腫瘤的多藥耐藥則成為嚴(yán)重影響化療效果主要原因之一。腫瘤多藥耐藥在臨床腫瘤治療中已普遍存在，成為目前腫瘤治療的主要障礙之一。
　　 多藥耐藥(MDR)是導(dǎo)致化療失敗的主要原因

2、，因此腫瘤耐藥成為臨床上腫瘤治療的最大挑戰(zhàn)。在過(guò)去的幾十年里，許多的理論方法被提出并用來(lái)解決這一問(wèn)題，其中最重要的就是耐藥逆轉(zhuǎn)藥物。多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。目前，用來(lái)闡述MDR產(chǎn)生機(jī)制的理論有多種，其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的ABCB1(MDR1/Pgp)、ABCC1-MRP1和ABCG2-BCRP是最佳的，特別是ABCB1(MDR1)編碼的P

3、-gp通過(guò)積極外排多種抗腫瘤藥物在腫瘤耐藥中起著關(guān)鍵作用。已知的P-gp的底物包括某些抗腫瘤藥物，例如:紫杉醇(paclitaxel)阿霉素(doxorubicin)和長(zhǎng)春新堿(vinblastine)。
　　 近年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞(CSC)學(xué)說(shuō)的提出更加豐富了腫瘤耐藥機(jī)制的研究。近年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞(CSC)學(xué)說(shuō)的提出更加豐富了腫瘤耐藥機(jī)制的研究。CSC學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤組織中存在極少量腫瘤細(xì)胞，與大部分已分化和不能自我更新的腫瘤細(xì)胞相

4、比，其具有自我更新、多向分化以及推動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)的能力。腫瘤干細(xì)胞(CSC)學(xué)說(shuō)還認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤耐藥、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源，這是由于化療藥物能夠殺死已分化或正在分化的腫瘤細(xì)胞卻不能殺死腫瘤干細(xì)胞。
　　 鹽霉素(Salinomycin)是一種羧酸聚醚類抗生素。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)，鹽霉素不僅可以抑制和殺滅腫瘤細(xì)胞，而且體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明其尚可抑制腫瘤干細(xì)胞。鹽霉素抑制乳腺癌腫瘤干細(xì)胞比例的能力是普通化療藥物的100多倍。其作為抗腫瘤和抗

5、腫瘤干細(xì)胞藥物的機(jī)制尚未闡明，但通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分化而非觸發(fā)細(xì)胞毒性的可能性較大。進(jìn)一步的研究證明，鹽霉素通過(guò)克服多重耐凋亡機(jī)制的作用，誘導(dǎo)不同來(lái)源的人類腫瘤細(xì)胞發(fā)生大量調(diào)凋亡。最近，通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)P-gp的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥物外排實(shí)驗(yàn)表明鹽霉素是多藥耐藥蛋白P-gp的較強(qiáng)抑制劑。
　　 研究目的:
　　 檢測(cè)胃癌耐藥細(xì)胞系SGC-7901/VCR的多重耐藥性，分析相關(guān)耐藥機(jī)制;觀察和探討鹽霉素逆轉(zhuǎn)SGC-7901/VCR多藥

6、耐藥性的效果及機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、選擇胃癌細(xì)胞系SGC-7901和SGC-7901/VCR細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期、多重耐藥性等體外生物學(xué)特性。
　　 2、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)對(duì)比兩細(xì)胞株在體內(nèi)的致瘤性。
　　 3、通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法分析耐藥細(xì)胞SGC-7901/VCR的耐藥機(jī)制:
　　 3.1、流式檢測(cè)兩細(xì)胞系中的側(cè)群比例，并用Western blot檢

7、測(cè)與之相關(guān)的常見(jiàn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2以及MDR1/Pgp的表達(dá);
　　 3.2、流式檢測(cè)胃癌干細(xì)胞標(biāo)記CD44、EpCAM在兩細(xì)胞的表達(dá)量及差異;
　　 3.3、通過(guò)腫瘤球的培養(yǎng)，間接檢測(cè)兩細(xì)胞株中干細(xì)胞比例的差異;
　　 3.4、Western blot檢測(cè)常用干細(xì)胞因子Nanog、SOX-2、OCT3/4及C-myc在兩細(xì)胞株的表達(dá)量及差異。
　　 4、用鹽霉素處理兩細(xì)胞株，通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)方法觀察其

8、逆轉(zhuǎn)耐藥株SGC-7901/VCR的效果，并探討其機(jī)制:
　　 4.1、MTT法檢測(cè)鹽霉素抑制兩細(xì)胞株增值的IC50值，觀察耐藥株是否對(duì)鹽霉素耐藥;
　　 4.2、聯(lián)合應(yīng)用鹽霉素和VCR，MTT檢測(cè)其耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù);
　　 4.3、MDR efflux assay檢測(cè)鹽霉素對(duì)耐藥細(xì)胞株蓄積ADM的作用;
　　 4.4、流式檢測(cè)兩細(xì)胞凋亡率的變化及差異;
　　 4.5、流式檢測(cè)耐藥細(xì)胞株側(cè)群比例的變化

9、，并用WB檢測(cè)相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量變化;
　　 4.6、流式檢測(cè)EpCAM的表達(dá)變化;
　　 4.7、不同濃度鹽霉素處理兩細(xì)胞株后做腫瘤球培養(yǎng)，觀察其對(duì)腫瘤球形成的抑制作用，并WB檢測(cè)相關(guān)干細(xì)胞因子的表達(dá)量變化。
　　 5、統(tǒng)計(jì)方法
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析;多種樣本比較One-way ANOVA比較各組細(xì)胞的差異，用LSD法進(jìn)行多重比

10、較;如果方差不齊，采用近似F檢驗(yàn)（Welch法）及多重比較的Tamhane法分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。
　　 結(jié)果:
　　 1.耐藥細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　 (1).光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)
　　 SGC-7901細(xì)胞呈上皮樣單層排列貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞大小不一，大部分以多角形細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，梭形細(xì)胞和巨大細(xì)胞所占比例均極少，細(xì)胞邊界清楚，增殖較迅速，可培養(yǎng)3d-4d傳代一次。SGC-7901/VC

11、R細(xì)胞同樣呈上皮樣單層排列貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞大小不一，大部分呈梭形，細(xì)胞增殖迅速，可培養(yǎng)3d-4d傳代一次。
　　 (2).細(xì)胞增殖
　　 MTT檢測(cè)測(cè)定OD值，并繪制細(xì)胞增殖曲線，SGC-7901、SGC-7901/VCR細(xì)胞均有接觸抑制期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和細(xì)胞死亡期。自第5天開(kāi)始，SGC-7901/VCR和SGC-7901細(xì)胞的體外增殖能力具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=24.755，P=0.000)。流式檢測(cè)兩株細(xì)胞的細(xì)胞周期，SGC

12、-7901細(xì)胞的G0/G1、S和G2/M三期的比例分別為44.700±1.400％、43.366±3.197％和11.933±2.074％，SGC-7901/VCR細(xì)胞的分別為37.200±1.908％、56.133±2.747％和6.667±1.518％; SGC-7901細(xì)胞的PI（增殖指數(shù)，表示細(xì)胞的增殖活性）為55.300±1.400％，SGC-7901/VCR細(xì)胞PI為62.800±1.908％，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-

13、5.489，P=0.005)。
　　 (3).裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)
　　 注射細(xì)胞總數(shù)分別為5×106，1×106，1×105和1×104個(gè)SGC-7901/VCR細(xì)胞觀察4W，均可見(jiàn)瘤體形成，成瘤所需要的最低細(xì)胞數(shù)僅為10000個(gè)。而SGC-7901細(xì)胞注射細(xì)胞數(shù)目1×104個(gè)，觀察4W未見(jiàn)瘤體形成，注射1×105細(xì)胞才可見(jiàn)腫瘤形成。提示SGC-7901/VCR細(xì)胞較SGC-7901細(xì)胞有更強(qiáng)大的致瘤能力。
　　

14、(4). MTT檢測(cè)SGC-7901/VCR細(xì)胞的多藥耐藥性
　　 對(duì)VCR、ADM、Taxol、DDP這四種化療藥物，SGC-7901/VCR均顯示耐藥性，其IC50分別為2.530±0.287μM、9.030±0.737μM、0.583±0.076μM、3.327±0.172μM，而SGC-7901細(xì)胞則相對(duì)敏感，其IC50明顯較小，分別為0.073±0.020μM、0.340±0.118μM、0.066±0.008μM、1

15、.347±0.315μM，兩細(xì)胞任一相同藥物之間均具有顯著差異(P＜0.05)。耐藥細(xì)胞較親本細(xì)胞對(duì)四種化療藥物的耐藥倍數(shù)分別為36.0、27.0、7.10、2.46。
　　 2.SGC-7901/VCR細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制的研究
　　 (1).流式檢測(cè)SGC-7901和SGC-7901/VCR細(xì)胞SP比例分別為0.067±0.115％和88.900±11.966％，兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-12.858，P=0.0

16、06)。ABCtransporter家族與SP表型密切相關(guān)，特別是MDR1-Pgp和ABCG2，Western blot結(jié)果示SGC-7901細(xì)胞中MDR1-Pgp與ABCG2均不表達(dá)，而SGC-7901/VCR細(xì)胞不表達(dá)ABCG2，而是高表達(dá)MDR1-Pgp。在MDR1-Pgp的表達(dá)上，SGC-7901與SGC-7901/VCR細(xì)胞具有明顯的差異。
　　 (2).流式檢測(cè)SGC-7901和SGC-7901/VCR細(xì)胞中CD44

17、+細(xì)胞比例分別為95.400±3.400％和95.433±2.139％，均高表達(dá)CD44+細(xì)胞，沒(méi)有顯著差異(t=-0.014，P=0.989)。而EpCAM+細(xì)胞比例分別為22.733±2.554％和93.667±4.723％，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-22.883，P=0.000)。
　　 (3). SGC-7901與SGC-7901/VCR細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天以后發(fā)現(xiàn)SGC-7901細(xì)胞不形成或形成較小

18、的腫瘤球，SGC-7901/VCR細(xì)胞形成較大的腫瘤球。每1000個(gè)SGC-7901和SGC-7901/VCR細(xì)胞形成的腫瘤球個(gè)數(shù)分別為0和36.000±5.568個(gè)，兩者之間具有明顯的差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-11.199，p=0.000)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SGC-7901細(xì)胞表達(dá)只表達(dá)C-myc，而SGC-7901/VCR細(xì)胞表達(dá)Nanog和C-myc。在C-myc的表達(dá)上，SGC-7901與SGC-7

19、901/VCR細(xì)胞沒(méi)有差異;在Nanog的表達(dá)上，兩者具有明顯的差異。
　　 3.鹽霉素逆轉(zhuǎn)SGC-7901/VCR多藥耐藥及其機(jī)制的研究
　　 (1). MTT檢測(cè)鹽霉素對(duì)SGC-7901和SGC-7901/VCR細(xì)胞的劑量效應(yīng)，IC50分別為1.755±0.182μM和2.480±0.174μM，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-4.978，P=0.008)。經(jīng)1μM、2μM和4μM鹽霉素作用后，檢測(cè)SGC-7901/VCR細(xì)胞

20、對(duì)VCR的IC50分別為0.710±0.060μM、0.410±0.040μM和0.210±0.020μM，與未處理組(0μM)相比，均具有顯著差異(P＜0.05)。逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為3.420、5.930和11.57。MDRexfflux assay證實(shí)鹽霉素能增加SGC-7901/VCR細(xì)胞內(nèi)多柔比星的濃度，而且這種作用具有濃度依賴性。
　　 (2).在0μM、1μM、2μM和4μM鹽霉素作用后，SGC-7901細(xì)胞的凋亡率分別

21、為1.700±1.300％、21.433±4.496％、58.800±4.331％和79.800±3.869％，SGC-7901/VCR細(xì)胞的凋亡率分別為1.767±1.850％、21.033±5.804％、58.200±6.596％和81.233±3.037％。所以，隨著鹽霉素濃度的增加，SGC-7901和SGC-7901/VCR細(xì)胞的凋亡率都隨之增加(F=417.850，P=0.000)，相同藥物濃度下兩細(xì)胞的凋亡率沒(méi)有差異(F=0

22、.069，P=0.976)。
　　 (3). SGC-7901/VCR細(xì)胞經(jīng)不同濃度鹽霉素（0μM、1μM、2μM和4μM）作用48h后，收集細(xì)胞行SP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SP比例隨著鹽霉素濃度的增加逐漸降低，分別為93.733±6.351％、54.967±5.784％、30.567±4.92％和11.700±2.663％(F=128.332，P=0.000)，而MDR1-Pgp的表達(dá)量也隨之逐漸降低。
　　 (4).SGC-79

23、01/VCR細(xì)胞經(jīng)不同濃度鹽霉素0μM、1μM、2μM和4μM處理48h后，繼續(xù)在無(wú)血清培養(yǎng)基下培養(yǎng)腫瘤球，約30d后發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度逐漸增加，腫瘤球的形成逐漸受到抑制，而且腫瘤球的大小也隨之變小。干細(xì)胞因子Nanog表達(dá)量也隨之降低。
　　 (5).鹽霉素可降低SGC-7901和SGC-7901/VCR細(xì)胞EpCAM+細(xì)胞的比例，兩細(xì)胞經(jīng)不同濃度鹽霉素（0μM、1μM、2μM和4μM）作用48h后，流式檢測(cè)EpCAM+細(xì)胞的

24、比例分別為:26.667±2.616％、20.600±4.444％、66.667±1.242％和2.767±0.603％;90.500±5.839％、57.067±6.467％、21.567±6.048％和7.900±4.158％。
　　 隨著藥物濃度的增加，每種細(xì)胞各個(gè)處理組之間均具有顯著差異(F=177.240，P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1.與親代細(xì)胞SGC-7901相比，耐藥細(xì)胞SGC-790