重組腺病毒介導(dǎo)的人ING4基因?qū)ξ赴┒嗨幠退幖毎闟GC7901-CDDP耐藥逆轉(zhuǎn)機制的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、目的:1.建立順鉑耐藥型胃癌細胞株SGC7901/CDDP(2ug/ml),為研究胃癌化療多藥耐藥提供細胞基礎(chǔ);2.體內(nèi)外實驗研究重組腺病毒介導(dǎo)的人ING4(inhibitor of growth4,生長抑制因子4)基因表達對胃癌多藥耐藥細胞株SGC7901/CDDP的耐藥逆轉(zhuǎn)效果和潛在分子機制。
　　方法和結(jié)果:
　　一、順鉑耐藥型胃癌細胞株SGC7901/CDDP(2ug/ml)的建立和其多藥耐藥特性的鑒定
　　應(yīng)

2、用逐步增加培養(yǎng)基中順鉑(Cisplatin, CDDP)濃度(從0.05ug/ml至2ug/ml)持續(xù)作用的方法誘導(dǎo)親本敏感胃癌細胞株SGC7901對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥,培養(yǎng)順鉑耐藥型胃癌細胞株SGC7901/CDDP(2ug/ml)。采用CCK-8法測定ADM、5-FU和CDDP對SGC7901/CDDP和 SGC7901細胞的半數(shù)抑制濃度(50％inhibiting concentration, IC50),確定SGC7901/C

3、DDP的多藥耐藥特性。熒光定量PCR法鑒定SGC7901/CDDP細胞和SGC7901細胞的多藥耐藥和細胞凋亡相關(guān)基因的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過逐步持續(xù)增加順鉑濃度半年,我們成功培養(yǎng)出順鉑耐藥型胃癌細胞株。相對于敏感株SGC7901,其對CDDP、5-FU和ADM的耐藥倍數(shù)分別為19.92、7.53和6.68。熒光定量PCR結(jié)果顯示:SGC7901/CDDP較SGC7901細胞MDR1、MRP1、Bcl-2和Survivin基因表達升高

4、,而Bax基因表達明顯降低。
　　二、重組腺病毒介導(dǎo)的人ING4基因表達對胃癌多藥耐藥細胞株SGC7901/CDDP的耐藥逆轉(zhuǎn)機制的體內(nèi)外實驗研究
　　用本實驗室已保存的高純度、高效價的帶有ING4基因的復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-ING4(100MOI)及空病毒 Ad-GFP(100MOI)感染胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/CDDP,RT-PCR和Western blot法鑒定ING4基因和蛋白在SGC7901/CDDP細胞中

5、表達情況。為進一步研究Ad-ING4對SGC7901/CDDP細胞的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)效果和可能機制,體外細胞實驗部分用CCK-8法進一步測定ADM、5-FU和CDDP對過表達ING4的SGC7901/CDDP細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)的變化以及熒光定量PCR法測定多藥耐藥相關(guān)基因MDR1、MRP1和細胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2和Survivin的表達變化情況。體內(nèi)動物實驗部分建立SGC7901/CDDP細胞裸鼠人胃癌移植瘤模型,觀

6、察Ad-ING4介導(dǎo)的ING4表達在體內(nèi)對裸鼠人胃癌移植瘤的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。免疫組化法檢測多藥耐藥和細胞凋亡相關(guān)蛋白P-gp、MRP1、Bax、Bcl-2和Survivin的表達。上述實驗結(jié)果顯示:ING4基因和蛋白在SGC7901/CDDP細胞中成功表達, CCK-8法顯示CDDP、5-FU和ADM對過表達ING4的SGC7901/CDDP細胞的IC50明顯減低,耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為9.86、4.09和2.23;熒光定量PCR顯示過表達I

7、NG4后SGC7901/CDDP細胞MDR1、MRP1、Bcl-2和Survivin基因表達顯著降低,而Bax基因表達明顯升高;體內(nèi)實驗結(jié)果表明:Ad-ING4治療后移植瘤生長明顯受到抑制,具有明顯的抑瘤增敏效應(yīng),進一步免疫組化顯示Ad-ING4能明顯降低P-gp、MRP1、Bcl-2、Survivin蛋白的表達和升高Bax蛋白的表達。
　　結(jié)論:
　　1.通過體外連續(xù)誘導(dǎo)胃癌親本細胞SGC7901成功獲得2ug/ml的順鉑