靶向mTOR增敏順鉑對胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901-DDP的作用.pdf

1、目的：靶向mTOR/p70S6K基因干擾增敏順鉑對胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP的作用，并探討其相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、500ng/ml順鉑(cisplatin，DDP)、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，1.給予轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記siRNA(FAM-siRNA)6h后，熒光顯微鏡檢測篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)染最佳濃度，以最佳濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；p70S6

2、K-siRNA轉(zhuǎn)染(40pmol/μl)、DDP(2.5mg/L)作用SGC7901/DDP細(xì)胞后：2.MTT法檢測各組細(xì)胞24h、48h、72h增殖情況；藥物作用細(xì)胞48h后：3.HE染色觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；4.RT-PCR檢測各組細(xì)胞GST、MRP1、survivin mRNA的表達(dá)水平；5.免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Western-blot檢測各組細(xì)胞中survivin、p-JNK、P-gp、MRP1蛋白的表達(dá)情況；6.檢測各組細(xì)胞內(nèi)

3、GSH含量和GST活力。
　　結(jié)果：1.不同濃度熒光標(biāo)記的siRNA(siRNA/脂質(zhì)體(pmol/μl)：20，40，60，80組)轉(zhuǎn)染6h后均可成功轉(zhuǎn)入SGC7901/DDP細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光散在分布于各組細(xì)胞質(zhì)中，其中40pmol/μl組轉(zhuǎn)染率最高(P<0.05)；2。2.5mg/LDDP單獨(dú)應(yīng)用對SGC7901/DDP細(xì)胞增殖無抑制作用，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)

4、染SGC7901/DDP細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到不同程度抑制，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染聯(lián)合DDP作用，藥物對細(xì)胞增殖的抑制更明顯，與p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3.p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染聯(lián)合DDP組SGC7901/DDP細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞稀疏，體積變小、形態(tài)不規(guī)則、胞漿濃縮等形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；4.藥物作用48h后檢測各組GSH含量和GST活力，p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)

5、染組與對照組、DDP組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中轉(zhuǎn)染聯(lián)合DDP組GSH含量的降低和GST活力的下降最為明顯，與其余各組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)5。RT-PCR結(jié)果顯示SGC7901/DDP細(xì)胞中GST、survivin及MRP1的mRNA的表達(dá)水平在對照組及DDP組最高，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞經(jīng)p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染聯(lián)合DDP后，GST、survivin及MRP1的mRN

6、A水平表達(dá)下降，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合作用組與轉(zhuǎn)染組相比差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)6.免疫細(xì)胞化學(xué)及Western-blot檢測結(jié)果顯示：DDP單獨(dú)作用于SGC7901/DDP細(xì)胞，各蛋白表達(dá)情況與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染聯(lián)合DDP后細(xì)胞中survivin、p-JNK、P-gp、MRP1蛋白的表達(dá)下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中轉(zhuǎn)染聯(lián)合DDP

7、組SGC7901/DDP細(xì)胞中survivin、p-JNK、P-gp、MRP1的表達(dá)下降明顯，與單獨(dú)p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.靶向mTOR下游的p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901/DDP細(xì)胞，可以抑制細(xì)胞增殖，聯(lián)合順鉑具有協(xié)同作用，細(xì)胞對順鉑的敏感性增強(qiáng)。2.增敏順鉑對SGC7901/DDP作用的機(jī)制與mTOR/p70S6K/JNK通路下調(diào)P-gp、MRP1及GS