TPA逆轉(zhuǎn)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對(duì)格列衛(wèi)耐藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、格列衛(wèi)(甲磺酸伊馬替尼,STI571)是一種酪氨酸激酶抑制劑,可抑制Bcr-Abl融合基因中Abl基因的酪氨酸激酶活性,從而特異性抑制費(fèi)城染色體陽(yáng)性(Ph<'+>)細(xì)胞增生和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.2001年5月美國(guó):FDA批準(zhǔn)其作為慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia;CML)患者在急變期、加速期或慢性期干擾素-a治療失敗后的一種口服治療方案;2003年5月進(jìn)一步獲批準(zhǔn)用于各期CML.國(guó)內(nèi)近兩年應(yīng)用亦較多.

2、現(xiàn)已被公認(rèn)為目前治療慢性粒細(xì)胞白血病的一線(xiàn)藥物.但臨床研究注意到,有相當(dāng)一部分起初對(duì)STI571治療有反應(yīng)的CML患者,較快出現(xiàn)了耐藥;即便是慢性期患者,也有45﹪～50﹪的患者在治療前9個(gè)月未能獲得遺傳學(xué)緩解,即出現(xiàn)了遺傳學(xué)耐藥.最近的研究已經(jīng)提示,這種耐藥現(xiàn)象的發(fā)生可能是Bcr/Abl陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生Bcr/Abl基因擴(kuò)增或過(guò)度表達(dá)的結(jié)果;再者,MDR<,1>基因及其產(chǎn)物P-糖蛋白的過(guò)度表達(dá)也可能與耐藥形成有關(guān).然而,這些觀(guān)點(diǎn)也許只能用

3、以解釋小部分臨床上CML對(duì)STI571的耐藥現(xiàn)象.越來(lái)越多的證據(jù)提示,CML起源于CML的白血病干細(xì)胞(leukemia stem cell;LSC),其分化出的相對(duì)成熟的子代細(xì)胞構(gòu)成了白血病細(xì)胞的主體,STI571對(duì)這部分白血病細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用,但慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞對(duì)STI571可能是部分、甚至是完全耐藥. 12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetate

4、;TPA)是一種從巴豆油中提取的蛋白激酶C(protein kinase C;PKC)激活物,具有最高的促癌活性同時(shí)也是最強(qiáng)的誘導(dǎo)分化劑之一.它具有誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞分化、促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和淋巴因子分泌的作用,自1979年Huberman等發(fā)現(xiàn)人早幼粒細(xì)胞可被TPA誘導(dǎo)分化以來(lái),已被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)研究,它可誘導(dǎo)HL-60、HEL等多種白血病細(xì)胞株細(xì)胞的分化,促使除巨核系祖白血病細(xì)胞株外的上述細(xì)胞向單核/巨噬細(xì)胞分化,出現(xiàn)單核/巨噬

5、細(xì)胞的某些表型和功能,以及酶學(xué)的變化.已有文獻(xiàn)報(bào)道TPA對(duì)原代白血病細(xì)胞有誘導(dǎo)分化作用,以向單核/巨噬樣細(xì)胞分化為主,且不同分型病例對(duì)TPA誘導(dǎo)反應(yīng)強(qiáng)弱不同,同一分型不同個(gè)體之間也存在著一定差異.在體外,低濃度(10<'-6>6mol/L～10<'-8>mol/L)的TPA對(duì)小鼠和人多種白血病細(xì)胞系具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)分化作用,臨床上也觀(guān)察到TPA對(duì)難治/復(fù)發(fā)白血病有一定療效. 最近,我們從慢性粒細(xì)胞白血病患者的骨髓中分離出-Bcr/Abl融

6、合基因陽(yáng)性、免疫表型為Flkl<'+>CD34細(xì)胞群體,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該細(xì)胞可在單細(xì)胞水平上同時(shí)向造血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞分化,且分化出的細(xì)胞均表達(dá):Bcr/Abl融合基因.這就提示我們所分離出的具有血液血管干細(xì)胞特性的Flkl<'+>CD34-細(xì)胞可能是慢性粒細(xì)胞白血病的干細(xì)胞.在本研究中,我們利用Flkl<'+>CD34-細(xì)胞,初步探討了ST1571對(duì)處于不同分化階段的慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞的敏感性,旨在進(jìn)一步了解STl571對(duì)CML患

7、者體內(nèi)Bcr/Abl融合基因陽(yáng)性的原始及處于分化階段的白血病干/祖細(xì)胞分化和增殖的影響,從而更深入闡明部分CMLL患者在經(jīng)歷一段血液學(xué)甚至是細(xì)胞遺傳學(xué)水平上的完全緩解后復(fù)發(fā)及對(duì)ST1571耐藥的機(jī)制;并且初步探討了TPA聯(lián)合ST1571克服CML患者對(duì)ST157l耐藥現(xiàn)象的可能,從而為臨床采用TPA聯(lián)合ST1571克服CML耐藥現(xiàn)象提供理論依據(jù). 對(duì)象與方法 1.病例選擇: 選擇CML患者15例(Ph<'+>),

8、均為男性,年齡19～65歲,均處于CML慢性期,就診前均沒(méi)有接受過(guò)羥基脲或干擾素治療.具體資料見(jiàn)表1; 2.Bcr/Abl<'+>Flkl<'+>CD3rCD34-慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞的分離:淋巴細(xì)胞分離液分離CMI.患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞,免疫磁珠分選CD45-、HlyA-及CD34-細(xì)胞,極限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞并檢測(cè)其生物學(xué)特性; 3.Bcr/Abl<'+>Flkl<'+>CD31-CD34-慢粒白血病干細(xì)胞耐藥性檢

9、測(cè):體外檢測(cè)ST1571對(duì)Bcr/Abl<'+>:Flkl<'+>CD3rCD34-細(xì)胞在造血集落培養(yǎng)基中分化及處于不同分化階段時(shí)的增殖抑制及促凋亡作用;采用流式細(xì)胞術(shù)將Bcr/Abl<'+>Flkl<'+>CD31 CD34.細(xì)胞分為三個(gè)亞群,即G<,0>期、G<,1>期及S/G<,2>+M細(xì)胞,分別評(píng)估TPA單獨(dú)應(yīng)用、STl571單獨(dú)應(yīng)用及TPA聯(lián)合STl571對(duì)三個(gè)亞群細(xì)胞的體外增殖及凋亡的影響.結(jié)果1.濃度為5 μM ST157

10、1,維持作用96小時(shí)(病人體內(nèi)維持96小時(shí)的ST1571濃度只可能達(dá)到1～2μM),即可有效抑制定向造血祖細(xì)胞的增殖;沒(méi)有充分的證據(jù)顯示相對(duì)原始的Bcr/Abl融合基因陽(yáng)性、免疫表型為Flk1<'+>CD34<'->的細(xì)胞的分化及增殖受到明顯的抑制作用; 2.G<,0>期Bcr/Abl<'+>Flk1<'+>CD31<'->CD34<'->細(xì)胞對(duì)ST1571的耐藥性明顯強(qiáng)于G<,1>期及S/G<,2>+M細(xì)胞;TPA聯(lián)合ST15

11、71可明顯增強(qiáng)ST1571對(duì)Bcr/Abl<'+>Flk1<'+>CD31<'->CD34<'->細(xì)胞的增殖抑制及促凋亡作用.結(jié)論1.ST1571也許不能清除體內(nèi)相對(duì)原始的CMI,白血病干細(xì)胞;ST1571對(duì)相對(duì)原始的CML白血病干細(xì)胞不敏感可能是ST1571產(chǎn)生臨床耐藥及CML復(fù)發(fā)的一根本原因; 2.TPA和ST1571聯(lián)用可有效增強(qiáng)ST1571對(duì)CML白血病細(xì)胞、尤其是處于G<,0>期的CML白血病干細(xì)胞的清除作用;TPA和