小檗胺對(duì)耐藥的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的體內(nèi)外作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)是造血干細(xì)胞惡性克隆增殖性疾病，占血液系統(tǒng)腫瘤的15％-20％，發(fā)病率為1-2/10萬。約有95％的CML患者存在Ph染色體，即9號(hào)染色體c—abl癌基因易位到22號(hào)染色體的bcr基因處，形成bcr—abl融合基因，bcr—abl融合基因編碼BCRABL融合蛋白，該蛋白具有異?；钴S的酪氨酸激酶活性，激活Ras/Raf/MEK/ERK，PI3K/AKT，JAK—STA

2、T等通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致CML的發(fā)生和發(fā)展。Imatinibmesylate(STI571，GleevecorGlivec，Novartis)是BCR—ABL酪氨酸激酶活性抑制劑，對(duì)Ph+的CML患者具有良好的療效，并于2001年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)成為治療CML的一線藥物。然而，隨著imatinib在臨床的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)一部分患者出現(xiàn)耐藥。CML對(duì)imatinib耐藥的機(jī)制涉及到很多方面，包括BCR—ABL點(diǎn)

3、突變或bcr—ab1在基因水平、mRNA水平、蛋白水平擴(kuò)增，多藥耐藥基因(multi—drugresistancegene，mdr-1)mRNA和其蛋白產(chǎn)物P—glyco—protein(Pgp)過表達(dá)，克隆演變，新的染色體異常出現(xiàn)，LYN激酶的過表達(dá)等。 克服imatinib耐藥是當(dāng)前血液界在CML治療中關(guān)注的焦點(diǎn)。已有研究表明法尼基抑制劑SCH66326和lonafarnib，Src/ABL家族酪氨酸激酶抑制劑dasatin

4、ib和bosutinib，高三尖杉酯堿對(duì)部分imatinib耐藥的白血病患者有效。其他藥物還有蛋白酶體抑制劑Velcade，DNA甲基化抑制劑地西他濱decitabine等單用或聯(lián)合imatinib可以治療部分耐藥的患者。盡管這些藥物和其他的新藥可以治療耐藥的患者，但是由于副作用或費(fèi)用昂貴等原因限制了它們的應(yīng)用。所以，迫切地需要研究新的低毒高效的治療CML的藥物。 小檗胺(berbamine)，是從中草藥小檗屬植物三顆針中提取的

5、一種雙芐基異喹啉類生物堿，被廣泛用于治療各種原因尤其是腫瘤化療引起的白細(xì)胞減少癥已數(shù)十年。我們課題組以往的研究顯示小檗胺可以抑制白血病細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡，包括K562細(xì)胞，Jurkat細(xì)胞，NB4細(xì)胞，而且對(duì)正常人的骨髓細(xì)胞無明顯副作用。但是關(guān)于小檗胺對(duì)耐藥的K562細(xì)胞作用研究甚少。本研究以多藥耐藥CML細(xì)胞株K562-resistant(K562-r)細(xì)胞為研究對(duì)象，研究小檗胺在對(duì)耐藥的CML細(xì)胞的體內(nèi)外作用，探討其可能的作用機(jī)制

6、及小檗胺應(yīng)用于CML治療的可行性。 第一部分：小檗胺對(duì)耐藥的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562-r細(xì)胞增殖和凋亡的影響 目的：檢測(cè)小檗胺對(duì)耐藥的人慢性粒細(xì)胞白血病K562-r細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法：MTT法檢測(cè)小檗胺，imatinib，或兩藥聯(lián)合對(duì)K562-r細(xì)胞的抗增殖作用。Wright—Giemsa染色、Hoechst33258染色觀察K562-r細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，瓊脂糖凝膠電泳分析小檗胺作用后K562-

7、r細(xì)胞DNA有無出現(xiàn)梯型條帶，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。RT—PCR擴(kuò)增和測(cè)序的方法檢測(cè)BCR—ABL激酶區(qū)序列。RT—PCR和Westernblot方法檢測(cè)bcr—ab1和mdr-1基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，以及凋亡相關(guān)蛋白PARP的表達(dá)。 結(jié)果：小檗胺對(duì)K562-r細(xì)胞具有增殖抑制作用，這種作用呈濃度—時(shí)間依賴關(guān)系。24h和48h的IC50分別為12.9μg/ml和8.4μg/ml。小檗胺能增強(qiáng)K562-r細(xì)胞對(duì)

8、imatinib的敏感性，使得K562-r細(xì)胞對(duì)imatinib的IC50從2.23μM降低到0.35μM。小檗胺能誘導(dǎo)K562-r細(xì)胞凋亡，經(jīng)16μg/ml小檗胺作用后K562-r細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞的特征性改變，DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察到典型的梯型條帶，流式細(xì)胞儀細(xì)胞DNA含量測(cè)定顯示小檗胺作用K562-R后sub—G1期細(xì)胞增加，并隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加，AnnexinV/PI熒光雙染分析結(jié)果也顯示凋亡細(xì)胞百分比隨著小檗胺

9、作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。并且發(fā)現(xiàn)小檗胺能下調(diào)bcr—abl基因在蛋白和mRNA水平的表達(dá)，明顯降低磷酸化BCR—ABL(phospho—BCR—ABL，pBCR—ABL)蛋白的表達(dá)，同時(shí)也能下調(diào)mdr-1基因在蛋白(P—gp)和mRNA水平的表達(dá)，另外經(jīng)小檗胺作用后的K562-r細(xì)胞PARP出現(xiàn)剪切片段。測(cè)序結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)采用的K562-r細(xì)胞在BCR—ABL激酶區(qū)無點(diǎn)突變。 結(jié)論：本研究結(jié)果提示小檗胺對(duì)K562-r細(xì)胞具有增殖抑

10、制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并能增加耐藥細(xì)胞對(duì)imatinib的敏感性；小檗胺對(duì)K562-r細(xì)胞的作用與下調(diào)K562-r細(xì)胞bcr—abl融合基因和mdr-1基因在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)有關(guān)；本實(shí)驗(yàn)采用的K562-r細(xì)胞BCR—ABL激酶區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變存在，此耐藥細(xì)胞對(duì)imatinib耐藥與BCR—ABL激酶區(qū)突變無關(guān)。 第二部分：小檗胺對(duì)K562-r細(xì)胞腫瘤信號(hào)通路影響的研究 目的：探討小檗胺對(duì)K562-r細(xì)胞增殖抑制

11、和誘導(dǎo)凋亡所涉及的信號(hào)通路。 方法：用腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)芯片(HS—044)，包括MAPK通路，Wnt通路，STAT通路，應(yīng)激通路(p53通路及p38/JNK通路)，survival/NF—κB通路與PI3K/AKT通路等信號(hào)通路共128個(gè)位點(diǎn)，檢測(cè)16μg/ml小檗胺處理前后腫瘤相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的差異，然后采用Westernblot方法進(jìn)行驗(yàn)證芯片結(jié)果，并檢測(cè)了與該分子相關(guān)的信號(hào)通路的其他伴隨分子。 結(jié)果：芯片結(jié)果顯示經(jīng)16

12、μg/ml小檗胺處理K562-r細(xì)胞前后分子表達(dá)差異主要涉及的是Bcl-2信號(hào)通路、炎癥/NF—κB信號(hào)通路、PI3K、MAPK等通路的有關(guān)分子。Westernblot結(jié)果顯示：(1)小檗胺對(duì)抗凋亡Bcl-2亞家族信號(hào)通路的影響：小檗胺下調(diào)K562-r細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl—xL，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)和胞漿細(xì)胞色素C的水平。(2)小檗胺對(duì)NF—κB信號(hào)通路的影響：小檗胺對(duì)K562-r細(xì)胞總NF—κB表達(dá)水平無影響，但能明

13、顯下調(diào)細(xì)胞核內(nèi)的NF—κB水平，雖然IκBα無變化，但phospho—IKBα(pIκBα)和IKKα和Survivin水平明顯降低。(3)小檗胺對(duì)PI3K信號(hào)通路的影響：小檗胺作用6h后，可見PI3K/p110亞單位的表達(dá)量明顯下調(diào)，但PI3K/p85、AKT、phospho—AKT(pAKT)的表達(dá)在藥物處理早期變化不明顯，在24h出現(xiàn)表達(dá)量下降。(4)小檗胺對(duì)MAPK通路的影響：小檗胺處理后可見ERK1/2、JNK和phospho

14、—JNK(pJNK)也有明顯下調(diào)。 結(jié)論：小檗胺通過多種信號(hào)途徑誘導(dǎo)K562-r細(xì)胞的凋亡，涉及Bcl-2蛋白家族、NF—κB信號(hào)通路，也與PI3K和MAPK信號(hào)通路的部分分子有關(guān)，但是誰是小檗胺誘導(dǎo)K562-r細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，則有待進(jìn)一步研究。 第三部分：小檗胺對(duì)耐藥的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的體內(nèi)作用的研究 目的：研究小檗胺在耐藥的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞荷瘤小鼠體內(nèi)的抗白血病作用。 方法：實(shí)驗(yàn)BAL

15、B/Cnu/nu裸鼠24只，分兩批進(jìn)行，每批12只，接種5×107K562-r細(xì)胞于裸鼠背部皮下，24h后將動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和小檗胺給藥組，每組各6只。小檗胺60mg/kg，iv，一天兩次，對(duì)照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥3周。觀察小檗胺抗腫瘤增殖的效果和毒副作用，主要指標(biāo)包括成瘤率、瘤體大小、瘤體重量及小檗胺對(duì)裸鼠外周血白細(xì)胞、肝、脾毒性作用。 結(jié)果：小檗胺在BALB/Cnu/nu荷瘤K562-r鼠體內(nèi)具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作