天然產物小檗胺增強伊馬替尼治療慢性粒細胞白血病的療效及機制研究.pdf

1、[研究背景]
　　慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種發(fā)生于造血干細胞水平的血液系統(tǒng)惡性克隆增生性疾病，在我國CML占總白血病發(fā)病率的20％左右。特征性Ph染色體是CML的標記性改變，它是由于t(9;22)(q34;q11)染色體易位形成的，從而導致BCR-ABL基因融合并表達210KD的BCR-ABL融合蛋白。第一代以BCR-ABL蛋白為靶標的分子靶向藥物—伊馬替尼(Imatinib

2、，IM)已成為治療CML的一線藥物，但其仍存在耐藥、停藥后易復發(fā)以及對CML急變療效差等諸多問題。并且，越來越多的臨床和實驗研究資料顯示，單用分子靶向藥物只能控制慢性期CML，而對加速期和急變期CML基本無效，更不能治愈CML。隨著近年來不斷深入的研究，揭示白血病干細胞(leukemia stem cell，LSC)是白血病復發(fā)和耐藥的主要根源，CML患者要獲得長期緩解和治愈，不僅需要殺死快速增殖的白血病細胞，而且還要清除處在休眠期的白

3、血病干細胞。令人遺憾的是，伊馬替尼類分子靶向藥物對白血病干細胞無效。
　　現(xiàn)代腫瘤的治療已從最初的單一用藥向聯(lián)合用藥方向轉變，從機制的互補、作用的協(xié)同、不良反應的減輕等方面發(fā)揮作用，其中關鍵之一是聯(lián)合化療藥物的選擇。越來越多的研究證據(jù)表明傳統(tǒng)中藥(traditional Chinese medicine，TCM)是白血病治療突破新的希望之一。小檗胺（Berbamine，BBM）是從我國中草藥小檗屬植物中提取的一種雙芐基異喹啉類生物

4、堿藥物。我們前期研究結果顯示，在體外小檗胺可以有效抑制對伊馬替尼耐藥的CML細胞的增殖，并且對正常造血細胞增殖沒有明顯抑制作用。CaMKIIγ激酶是小檗胺抗慢性粒細胞白血病作用的關鍵靶分子，是白血病干細胞治療性藥物靶標。這些證據(jù)提示著我們可以將小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合起來，從而達到對白血病更好的治療效果。因此本研究將對進該聯(lián)合用藥的可行性及優(yōu)勢進行分析，并對機制進行初步探討。
　　[研究目的]
　　1、比較天然小分子化合物小檗胺

5、、伊馬替尼和小檗胺聯(lián)合伊馬替尼對CML細胞的清除作用;
　　2、應用小鼠模型比較小檗胺、伊馬替尼和小檗胺聯(lián)合伊馬替尼對體內CML藥效;
　　3、初步探討小檗胺、伊馬替尼和小檗胺聯(lián)合伊馬替尼抗白血病作用機制。
　　[研究方法]
　　1、MTT法檢測不同濃度單藥小檗胺、單藥伊馬替尼及小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合給藥方案對伊馬替尼耐藥的K562細胞或BCR-ABL T315I耐藥突變的KCL-22M的清除作用，計算聯(lián)合指數(shù)(c

6、ombination index，CI);
　　2、軟瓊脂克隆形成實驗檢測不同濃度單藥小檗胺、單藥伊馬替尼及小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合給藥方案對白血病細胞系的克隆形成能力的影響;
　　3、應用流式細胞術Annexin-Ⅴ/PI雙標法觀察不同濃度單藥小檗胺、單藥伊馬替尼及小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合給藥方案對白血病細胞的凋亡影響;
　　4、應用Western blotting檢測相關信號分子，研究小檗胺聯(lián)合伊馬替尼誘導CML細胞死亡的

7、機制;
　　5、應用裸鼠體內人異種移植瘤模型評價單藥小檗胺、單藥伊馬替尼及小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合給藥方案對伊馬替尼耐藥的K562/ADR細胞生長影響。
　　[研究結果]
　　1.體外MTT證實小檗胺和伊馬替尼對K562、K562/ADR、KCL-22M、CML-BC四種細胞均有殺傷作用。72h IC50分別為:10.02±0.064μM、12.538±0.073μM、14.759±0.08μM、14.194±0.032μ

8、M和0.065±0.011μM、2.665±0.031μM、14.678±0.077μM、0.065±0.012μM;
　　2.小檗胺和伊馬替尼在CML細胞系中聯(lián)合使用CI＜1，具有協(xié)同作用，不僅可減少伊馬替尼劑量使用，并且可清除對伊馬替尼耐藥的K562細胞和BCR-ABLT315I耐藥突變的CML細胞;
　　3.軟瓊脂克隆形成實驗證實小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合使用可以協(xié)同抑制CML細胞克隆形成，72h MTT IC50藥物劑量聯(lián)

9、合使用后基本無克隆生長;
　　4.流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合使用可協(xié)同促進白血病細胞凋亡和壞死，72h MTT IC50藥物劑量聯(lián)合使用后，對K562和K562/ADR凋亡和壞死率分別達到69.1％和97.1％;
　　5.小檗胺下調伊馬替尼耐藥的K562細胞和BCR-ABL T315I耐藥突變的CML細胞融合蛋白p210 BCR-ABL水平，同時抑制CML干細胞存活必需的CaMKIIγ激酶活性。小檗胺和伊馬替尼聯(lián)

10、合后能使p210BCR-ABL蛋白水平下降更明顯;
　　6.體內異種移植瘤證實小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合可明顯協(xié)同抑制K562/ADR細胞在裸鼠體內的生長;裸鼠移植瘤實驗35天結束后發(fā)現(xiàn)在裸鼠移植瘤瘤重，瘤消退率等指標上聯(lián)合用藥均優(yōu)于單藥，數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，且裸鼠肝、腎等重要臟器未見肉眼損害。
　　[研究結論]
　　1、小檗胺可有效清除LSCs和BCR-ABL的T315I突變細胞，小檗胺能抑制CML細胞中C

11、aMKIIγ激酶活性，殺傷CML細胞。
　　2、小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合用藥具有協(xié)同效應。小檗胺能顯著協(xié)同伊馬替尼殺傷CML細胞，使細胞凋亡增加;聯(lián)合用藥能協(xié)同抑制BCR-ABL及其磷酸化蛋白的表達，提示小檗胺聯(lián)合伊馬替尼可能是逆轉耐藥。
　　3、治療劑量下小檗胺對裸鼠沒有明顯的毒副作用，小檗胺聯(lián)合伊馬替尼后能有效殺滅裸鼠體內增殖活躍的人慢性粒細胞白血病細胞
　　4、小檗胺能加強伊馬替尼的抗腫瘤療效，由于小檗胺的價格低廉，