天然小分子化合物小檗胺抗慢性粒細(xì)胞白血病作用靶分子鑒定及其作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種發(fā)生于造血干細(xì)胞水平的血液系統(tǒng)惡性克隆增生性疾病,在我國(guó)CML占總白血病發(fā)病率的20％左右。CML患者的骨髓細(xì)胞中可檢測(cè)到特異性的Ph染色體,它是由于t(9；22)(q34；q11)染色體易位形成的,從而導(dǎo)致BCR-ABL基因融合并表達(dá)210KD的BCR-ABL融合蛋白。BCR-ABL蛋白在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞惡性增殖過(guò)程中發(fā)揮著

2、重要作用,因而成為Ph+慢性粒細(xì)胞白血病的重要治療靶點(diǎn)。第一代以BCR-ABL蛋白為靶標(biāo)的分子靶向藥物-伊馬替尼(Imatinib,IM)已成為治療CML的一線(xiàn)藥物。然而,令人遺憾的是,伊馬替尼類(lèi)分子靶向藥物不能完全清除患者體內(nèi)BCR-ABL陽(yáng)性白血病細(xì)胞克隆,并不能使多數(shù)CML患者獲得長(zhǎng)期緩解,停藥后很快復(fù)發(fā),其中一些患者對(duì)伊馬替尼類(lèi)分子靶向藥物產(chǎn)生耐藥。并且,越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究資料顯示,單用分子靶向藥物只能控制慢性期CML,而

3、對(duì)加速期和急變期CML基本無(wú)效,更不能治愈CML。隨著近年來(lái)不斷深入的研究,揭示白血病干細(xì)胞(leukemia stem cell,LSC)是白血病復(fù)發(fā)和耐藥的主要根源,而伊馬替尼類(lèi)分子靶向藥物對(duì)白血病干細(xì)胞無(wú)效。因?yàn)榘籽「杉?xì)胞通常處在休眠狀態(tài),很難被伊馬替尼類(lèi)分子靶向藥物和經(jīng)典化療藥物清除,從而留下白血病復(fù)發(fā)根源。CML患者要獲得長(zhǎng)期緩解和治愈,不僅需要?dú)⑺揽焖僭鲋车陌籽〖?xì)胞,而且還要清除處在休眠期的白血病干細(xì)胞。已有研究表明很多

4、蛋白,如β-catenin,NF-κB等分子,與白血病干細(xì)胞的存活、自我更新和凋亡抵抗有關(guān)。但是這些分子在正常造血干細(xì)胞中也起著相似的作用,沒(méi)有明顯的特異性。因此,鑒定白血病干細(xì)胞特異性的蛋白靶標(biāo),并繼而研發(fā)新型分子靶向藥物就顯得十分迫切。
　　 小檗胺(Berbamine,BBM)是從我國(guó)中草藥小檗屬植物中提取的一種雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿藥物。多年來(lái)一直廣泛應(yīng)用于臨床,如抗炎和白細(xì)胞減少的治療。我們前期研究結(jié)果顯示,在體外小檗胺

5、可以有效抑制對(duì)伊馬替尼耐藥的CML細(xì)胞的增殖,但對(duì)正常造血細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯抑制作用。這表明小檗胺很可能對(duì)CML干細(xì)胞具有特異性殺傷作用,這將對(duì)CML的根治具有重要的臨床意義。因此本研究將對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 研究目的:
　　 1、研究天然小分子化合物小檗胺(BBM)對(duì)裸鼠慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞移植瘤的清除作用。
　　 2、篩選并鑒定BBM抗慢性粒細(xì)胞白血病作用的靶分子。
　　 3、闡明該靶分

6、子調(diào)控慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞存活、自我更新和凋亡抵抗的分子機(jī)制,從而明確BBM對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞清除作用的內(nèi)在分子機(jī)制。
　　 研究?jī)?nèi)容:
　　 1天然小分子化合物小檗胺(BBM)對(duì)裸鼠慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞移植瘤的清除作用研究
　　 我們分別用急變期CML細(xì)胞敏感株K562-S和耐受伊馬替尼(IM)的耐藥株K562-R(經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定含1-2％CD34+白血病干細(xì)胞)建立裸鼠荷瘤模型。結(jié)果顯示,荷瘤裸鼠連續(xù)

7、口服小檗胺(150mg／kg,每天1次)10天后,70％(14／20)K562-S白血病細(xì)胞異種移植瘤完全消退；荷瘤裸鼠連續(xù)口服小檗胺(100mg／kg,每天3次)10天后,其體內(nèi)伊馬替尼耐藥的K562-R白血病細(xì)胞移植瘤抑制率達(dá)到90.91％(10／11)。而且在實(shí)驗(yàn)觀察期間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的藥物毒副作用。
　　 2小檗胺抗慢性粒細(xì)胞白血病作用靶分子CaMKⅡγ激酶的鑒定
　　 本部分聯(lián)合應(yīng)用小檗胺親和基質(zhì),蛋白質(zhì)譜和We

8、stern blot技術(shù)方法發(fā)現(xiàn)并證實(shí):BBM能與活化的鈣離子／鈣調(diào)素依賴(lài)的蛋白激酶Ⅱγ(Calcium／calmodulin-dependent protein kinaseⅡγ,簡(jiǎn)稱(chēng)CaMKⅡγ)發(fā)生特異性作用。進(jìn)一步應(yīng)用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模型(molecular docking model)模擬顯示小檗胺主要以范德華力(van der Waals forces)與CaMKⅡγ激酶P44,V47,I64,V93,P109,V112和L1

9、62氨基酸殘基結(jié)合,并且其位置正好位于CaMKⅡγ激酶的ATP結(jié)合袋(ATPbinding pocket)。而Western blot結(jié)果顯示BBM處理白血病細(xì)胞后,CaMKⅡγ的磷酸化水平(pCaMKⅡγ)顯著降低,而CaMKⅡγ總蛋白水平?jīng)]有明顯變化。這提示小檗胺很可能通過(guò)與ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CaMKⅡγ激酶而抑制其磷酸化水平。
　　 3 CaMKⅡγ激酶調(diào)控慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞存活、自我更新和凋亡抵抗的分子機(jī)制研究

10、　　 3.1 CaMKⅡγ激酶在CD34+血病細(xì)胞中特異性異常激活
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞分選技術(shù)分選出CML干細(xì)胞,用Western blot技術(shù)對(duì)其CaMKⅡγ激酶表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)和分析。并檢測(cè)CaMKⅡγ激酶在CML干細(xì)胞與正常造血干細(xì)胞中的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)CaMKⅡγ激酶在CD34+的CML干細(xì)胞中呈特異性高表達(dá),并且其磷酸化水平也較高,而在相應(yīng)CD34-的CML細(xì)胞和正常造血干細(xì)胞中表達(dá)水平很低。
　　 3.2 C

11、aMKⅡγ激酶與CML干細(xì)胞的存活密切相關(guān),且促進(jìn)LSC的自我更新
　　 應(yīng)用特異性反義核酸下調(diào)K562細(xì)胞CaMKⅡγ激酶表達(dá)水平,觀察對(duì)細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,下調(diào)CaMKⅡγ激酶表達(dá)水平后,白血病克隆形成能力被明顯抑制。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)K562細(xì)胞CaMKⅡγ激酶表達(dá)水平,觀察CD34+的干細(xì)胞數(shù)目,以及對(duì)克隆形成能力的影響。發(fā)現(xiàn)上調(diào)CaMKⅡγ激酶表達(dá)水平可以增加CD34+的干細(xì)胞比例以及增強(qiáng)細(xì)胞克隆形成能力。

12、r>　　 3.3 CaMKⅡγ激酶促進(jìn)裸鼠CML異種移植瘤的成瘤能力
　　 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP和pcDNA3.1-CaMKⅡγ-EGFP的K562細(xì)胞分別接種至同一只裸鼠兩側(cè)皮下。通過(guò)比較兩側(cè)異種移植瘤的大小來(lái)觀察上調(diào)CaMKⅡγ激酶水平對(duì)白血病細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示CaMKⅡγ激酶高表達(dá)可以增強(qiáng)K562細(xì)胞裸鼠異種移植瘤成瘤能力。且發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CaMKⅡγ的K562細(xì)胞裸鼠異種移植腫瘤中,干細(xì)胞樣的原

13、始腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組。
　　 3.4 CaMKⅡγ激酶促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞存活,自我更新和凋亡抵抗的機(jī)制
　　 通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè),CaMKⅡγ激酶高表達(dá)對(duì)與LSC存活、自我更新和凋亡抵抗密切相關(guān)的重要信號(hào)分子蛋白β-catenin、GSK3β和Caspase-2等表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示,穩(wěn)定高表達(dá)CaMKⅡγ的K562細(xì)胞中,p-GSK和β-catenin的蛋白表達(dá)水平顯著升高,Cas

14、pase-2的表達(dá)水平明顯下降。而且流式分選結(jié)果顯示CML患者骨髓細(xì)胞中CD34+的CML干細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白高表達(dá)。提示CaMKⅡγ激酶可能通過(guò)磷酸化GSK3導(dǎo)致其活性被抑制,進(jìn)而解除GSK3對(duì)β-catenin的抑制作用,最終實(shí)現(xiàn)對(duì)Wnt／β-Catenin信號(hào)通路正調(diào)控,促進(jìn)LSC存活和自我更新；另一方面可能通過(guò)抑制Caspase-2活性,使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗。
　　 3.5 CaMKⅡγ激酶可能是調(diào)控GSK3／W

15、nt／β-catenin和線(xiàn)粒體／Caspase-2信號(hào)通路的重要分子開(kāi)關(guān),且能與GSK3分子形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體
　　 本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫共沉淀的方法,進(jìn)一步鑒定及證實(shí)慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡγ激酶主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體的核心組分。結(jié)果顯示,應(yīng)用CaMKⅡγ激酶特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀CaMKⅡγ激酶相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體,用Westernblot技術(shù)驗(yàn)證出在該復(fù)合體中存在β-catenin、GSK3／β和Caspase-2蛋

16、白。應(yīng)用GSK3／β特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀,并用Western blot技術(shù)驗(yàn)證出CaMKⅡγ蛋白能和GSK3／β結(jié)合。以上結(jié)果表明CaMKⅡγ激酶可能是調(diào)控GSK3／Wnt／β-catenin和線(xiàn)粒體／Caspase-2信號(hào)通路的重要分子開(kāi)關(guān),且能與GSK3分子形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體。
　　 3.6 CaMKⅡγ激酶抑制劑BBM對(duì)K562-R細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)重要分子β-catenin表達(dá)水平的抑制作用
　　 采用West

17、ern blot技術(shù)檢測(cè)BBM作為CaMKⅡγ激酶抑制劑,是否可以抑制LSC中與存活,自我更新和凋亡抵抗密切相關(guān)的重要信號(hào)分子β-catenin蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,BBM可以顯著抑制慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562-R的β-catenin蛋白表達(dá)水平。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、小檗胺不僅殺滅裸鼠體內(nèi)增殖活躍的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞,還可能清除處在休眠狀態(tài)的慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞,并且在治療劑量下小檗胺對(duì)裸鼠沒(méi)有明顯的

18、毒副作用。
　　 2、CaMKⅡγ激酶是小檗胺抗慢性粒細(xì)胞白血病作用的靶分子。小檗胺能特異性結(jié)合CaMKⅡγ激酶的ATP結(jié)合袋結(jié)構(gòu)域,并抑制CaMKⅡγ的磷酸化。
　　 3、CaMKⅡγ激酶可能是調(diào)控GSK3／Wnt／β-catenin和線(xiàn)粒體／Caspase-2信號(hào)通路的重要分子開(kāi)關(guān)。CaMKⅡγ通過(guò)磷酸化GSK3導(dǎo)致其活性被抑制,進(jìn)而解除GSK3對(duì)β-catenin的抑制作用,最終實(shí)現(xiàn)對(duì)Wnt／β-Catenin信號(hào)