小分子化合物添加促進(jìn)靈芝酸的發(fā)酵生產(chǎn)及其作用機(jī)制探索.pdf

1、靈芝酸具有抗腫瘤等重要藥理活性,但其低生產(chǎn)率是制約其廣泛研發(fā)及應(yīng)用的瓶頸。本實驗室先前報道的兩階段液體靜置培養(yǎng)方法可大幅度提高靈芝酸的發(fā)酵產(chǎn)量,但仍難滿足其應(yīng)用需求。本學(xué)位論文探討了靈芝菌絲體兩階段發(fā)酵過程中,通過添加小分子化合物即苯巴比妥和咪康唑,使靈芝酸的發(fā)酵產(chǎn)量獲得進(jìn)一步的提高,并探討了添加劑對該次級代謝產(chǎn)物生物合成的作用機(jī)制。實驗結(jié)果表明,苯巴比妥的最佳添加量為100μM(終濃度),最佳添加時間為靜置培養(yǎng)第5天;靈芝酸的總含量達(dá)

2、41.4±0.6mg/gDW,其中單體靈芝酸Mk,-T,-S和-Me的最大含量比對照(添加DMSO)分別提高了30-60％;同時,代謝途徑中的三個重要基因,3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(hmgr),鯊烯合成酶(sqs)和羊毛甾醇合成酶(ls)的轉(zhuǎn)錄水平均有提高,而重要中間體羊毛甾醇的含量比對照條件有明顯下降,這表明苯巴比妥促進(jìn)了靈芝酸的生物合成代謝途徑,羊毛甾醇被更快地轉(zhuǎn)化成了產(chǎn)物靈芝酸。咪康唑的最佳添加條件為第7天添加10μM

3、(終濃度)。添加咪康唑后,總靈芝酸的含量達(dá)30.4±0.4mg/gDW,其中四種單體靈芝酸的含量分別比對照(添加DMSO)增加了20-35%;同時,細(xì)胞中麥角固醇的含量下降了約50%,而羊毛甾醇含量出現(xiàn)增加,這提示,咪康唑的添加抑制了細(xì)胞內(nèi)羊毛甾醇轉(zhuǎn)化成麥角固醇,從而促進(jìn)了羊毛甾醇向靈芝酸的轉(zhuǎn)化。此外,我們也檢測了代謝途徑中四個重要基因(hmgr,sqs,ls,以及14α-脫甲基酶(14α-ldm))的轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果表明,添加咪康唑