引起腫瘤細胞自噬的小分子化合物的發(fā)現及其機制研究.pdf

1、自噬是發(fā)生在真核細胞中由細胞初級溶酶體處理內源性底物的重要生理過程，生命體借此維持蛋白質代謝平衡及細胞內環(huán)境穩(wěn)定。自噬不僅對細胞清除廢物、重建結構以及生長發(fā)育起重要作用，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。發(fā)現促進細胞自噬的小分子抗腫瘤化合物，為新型抗腫瘤藥物發(fā)現打下基礎。 本文成功建立了在HCT-116細胞上自噬篩選的模型。選擇HCT-116、HeLa等細胞轉染pGFP-LC3質粒，轉染后加入新霉素抗性維持培養(yǎng)至被轉染的目的基因穩(wěn)定

2、整合到細胞的基因組中，形成單細胞克隆，挑選出帶有熒光的細胞克隆，用化合物長春堿檢測細胞內自噬發(fā)生的程度，熒光顯微鏡觀察GFP標記的LC3在細胞內的定位分布變化：由胞漿內彌散分布變?yōu)槌庶c狀分布于自噬泡的周圍，同時免疫印跡檢測LC3條帶的變化：由LC3Ⅰ變?yōu)長C3Ⅱ。 利用上述模型，從化合物庫里100多個具有抗腫瘤活性的化合物中挑選出28個在HCT-116細胞上的IC50在5.5μg/ml以下的化合物，以3倍IC50、9倍IC50的

3、化合物濃度與HCT-116細胞孵育24 h，收集細胞樣品進行蛋白質免疫印跡檢測。初篩得到11個有自噬活性的化合物，復篩得到6個有明顯自噬活性的化合物，選擇其中的一個化合物進行機制方面的研究。 該化合物名稱為physalinB，在多種細胞里有抗腫瘤活性。MTT法檢測了其在HCT-116細胞中的抗腫瘤活性，Western blot檢測其誘導HCT-116細胞的自噬具有明顯的時間、濃度依賴性，熒光顯微鏡觀察其引起了HCT-116穩(wěn)定細

4、胞株內綠色熒光呈點狀分布于自噬泡的周圍。Western blot檢測到自噬信號通路相關蛋白AKT的磷酸化降低、ERK的磷酸化水平增加及mTOR的磷酸化水平降低，Becin-1蛋白的表達量并沒有增加，而且該化合物所引起的自噬不能被經典的自噬的抑制劑3—MA所阻斷，可以被ERK的抑制劑PD98059反轉，同時檢測到凋亡早期蛋白PARP的剪切并能被caspase的抑制劑Z—VAD—FMK反轉。 該化合物引起自噬的信號通路是Ⅰ型的P13