饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬引起UVRAG分子的降解.pdf

1、目的：
　　觀察細(xì)胞發(fā)生自噬后UVRAG分子水平的改變及其與自噬發(fā)生的關(guān)系。
　　方法：
　　將pERFP-LC3真核表達(dá)載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RD-A細(xì)胞并與次日用不含胎牛血清的eagle’s液代替常規(guī)培養(yǎng)基，37℃、5％CO2的條件下饑餓培養(yǎng)6小時(shí)，用熒光顯微鏡觀察RFP-LC3聚集情況。將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RD-A細(xì)胞用不含胎牛血清的eagle’s液代替常規(guī)培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)2小時(shí)、6小時(shí)，用We

2、stern Blot檢測(cè)饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)LC3的型別轉(zhuǎn)換及UVRAG分子的水平改變；將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RD-A細(xì)胞用不含胎牛血清的eagle’s液代替常規(guī)培養(yǎng)基，同時(shí)應(yīng)用自噬起始階段抑制劑3-MA處理細(xì)胞，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6小時(shí)，用Western Blot檢測(cè)P62和LC3分子的改變及UVRAG分子水平的變化；將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RD-A細(xì)胞用不含胎牛血清的eagle’s液代替常規(guī)培養(yǎng)基，同時(shí)應(yīng)用溶酶體蛋白酶抑制劑E64d

3、和pepstatin A處理細(xì)胞，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6小時(shí)，Western Blot檢測(cè)P62和LC3分子的改變及UVRAG分子水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1．饑餓可以誘導(dǎo)或促進(jìn)RD-A細(xì)胞發(fā)生自噬；2．RD-A細(xì)胞饑餓2小時(shí)后， LC3可發(fā)生型別轉(zhuǎn)換，自噬已經(jīng)發(fā)生，但UVRAG分子的水平未見改變，饑餓6小時(shí)后細(xì)胞自噬進(jìn)一步發(fā)展，此時(shí)UVRAG分子水平也出現(xiàn)降低；3．用自噬抑制劑3-MA處理饑餓細(xì)胞，細(xì)胞自噬水