A族鏈球菌誘導細胞自噬機制的研究.pdf

1、目的:自噬(autophagy)是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜，包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器更新的基礎代謝過程。研究表明，多種因素諸如氧化應激、饑餓、高溫、細胞內(nèi)損傷、細菌病毒感染等，都會誘發(fā)細胞自噬。細胞自噬對于機體正常穩(wěn)態(tài)有重要意義:饑餓應答進程中，在不同的器官如肝臟或培

2、養(yǎng)細胞，由于氨基酸的匱乏，會誘導自噬，后者分解大分子，以產(chǎn)生分解代謝和合成代謝過程中所必須的中間代謝物;在細胞正?；顒舆^程中，如在動物的變態(tài)發(fā)育、老化和分化過程中，自噬負責蛋白降解以重建細胞。
　　A族鏈球菌(GAS)是一類革蘭氏陽性球菌，人類約90％的鏈球菌感染是由GAS引起的。感染GAS后可引起化膿性疾病，如局部皮膚及皮下組織感染等，中毒性疾病如猩紅熱等，變態(tài)反應性疾病如風濕熱、急性腎小球腎炎等。GAS較強的侵襲力主要取決于其

3、能產(chǎn)生多種胞外酶及毒素，例如脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)、M蛋白(M protein)、致熱外毒素(pyrogenic exotoxin)、溶血素(hemolysins)等。這些胞外酶和毒素都有其各自功能，例如脂磷壁酸可以增強細菌對宿主細胞的粘附性;M蛋白是GAS的主要毒力因子;致熱外毒素能改變血腦屏障的通透性;溶血素分為鏈球菌溶血素O和鏈球菌溶血素S，在鏈球菌引起超敏反應的過程中起著重要作用。在機體受到GAS

4、入侵時，是否會發(fā)生細胞自噬;如果發(fā)生，那么GAS誘導細胞自噬的機制是什么？這些問題目前尚不清楚。本研究通過western blot，免疫熒光技術等檢測FbaA+M+ GAS、FbaA-M+GAS缺陷菌株及FbaA+ M-GAS缺陷菌株刺激人喉癌上皮細胞Hep2后，檢測自噬相關蛋白LC3和P62的變化趨勢，以及用免疫熒光的方法檢測LC3蛋白的細胞原位表達變化來探究GAS全菌及其缺陷菌株是否誘導細胞發(fā)生自噬。而后，用純化的M蛋白，F(xiàn)baA蛋

5、白刺激Hep2細胞以驗證其在誘導自噬中的作用。接下來進一步用本室保存的分段蛋白刺激細胞，以尋找GAS誘導自噬發(fā)生的具體蛋白區(qū)段。
　　方法:
　　1.用FbaA+M+ GAS刺激人喉癌上皮細胞Hep2，并用人肺癌細胞A549作為對照組，在侵襲細胞后，根據(jù)滲透壓原理得到胞內(nèi)菌，不同倍數(shù)稀釋后涂于血平板培養(yǎng)基上，計算GAS的侵襲效率。
　　2.Hep2細胞分別接受FbaA+M+GAS，F(xiàn)baA-M+GAS缺陷菌株，F(xiàn)baA

6、+ M-GAS缺陷菌株刺激，用western blot檢測自噬相關蛋白LC3，P62在不同時間點的表達變化。
　　3.Hep2細胞分別接受FbaA+M+GAS，F(xiàn)baA-M+ GAS缺陷菌株，F(xiàn)baA+ M-GAS缺陷菌株刺激，應用免疫熒光技術檢測LC3的分布定位。
　　4.應用親和層析法純化FbaA蛋白，M蛋白。
　　5.Hep2細胞分別接受兩種蛋白的刺激后，用western blot檢測自噬相關蛋白LC3，P62在

7、不同濃度和不同時間點的表達變化。
　　6.用本實驗室保存的分段FbaA蛋白分別刺激Hep2細胞，用westernblot檢測自噬相關蛋白LC3，P62在不同濃度和不同時間點的表達變化。
　　結果:
　　1.Hep2細胞受到GAS感染時的平均侵襲率為33％，而A549為25.6％。
　　2.FbaA+M+GAS和FbaA+M-GAS缺陷菌株以MOI1∶100刺激Hep2細胞后，P62蛋白隨著刺激時間逐漸減少，LC3

8、的兩種蛋白LC3-1逐漸降低，而LC3-2逐漸增加;當FbaA-M+GAS缺陷菌株以MOI1∶100刺激細胞后，P62和LC3的兩種蛋白均沒有明顯的特征性變化。
　　3.免疫熒光檢測不同菌株刺激細胞后，LC3蛋白定位情況顯示:當FbaA+M+GAS和FbaA+ M-GAS缺陷菌株刺激Hep2細胞6小時后，LC3蛋白呈現(xiàn)出聚集分布。當FbaA-M+GAS缺陷菌株刺激細胞后，LC3蛋白的彌散分布狀態(tài)未改變。
　　4.FbaA蛋白

9、和M蛋白刺激細胞后，western blot結果顯示:當FbaA蛋白刺激細胞后，P62蛋白隨著刺激時間逐漸減少，同時LC3-1逐漸降低，而LC3-2逐漸增加;當M蛋白刺激細胞后，P62和LC3的兩種蛋白均沒有明顯的特征性變化。
　　5.FbaA的四種分段蛋白37-104，104-277，68-164，164-320，分別刺激Hep2細胞，結果顯示:68-164區(qū)段蛋白刺激Hep2細胞后，呈現(xiàn)出自噬相關蛋白LC3-1隨著時間逐漸降低

10、的趨勢，LC3-2隨著時間逐漸升高的趨勢;同時，自噬相關蛋白P62有隨著時間逐漸降低的趨勢。
　　結論:
　　1.GAS可以侵入Hep2及A549細胞，且侵襲率達到可研究水平。
　　2.FbaA+M+GAS及FbaA+ M-GAS缺陷菌株可誘導Hep2細胞發(fā)生自噬，而FbaA-M+GAS缺陷菌株并未誘導細胞自噬的發(fā)生。
　　3.GAS誘導Hep2細胞發(fā)生細胞自噬和GAS的毒性蛋白FbaA有關。
　　4.Fb