A族鏈球菌上調(diào)A20表達(dá)以抑制巨噬細(xì)胞功能的機(jī)制研究.pdf

1、目的:A族鏈球菌(Group A streptococcus，GAS)即化膿性鏈球菌，一類重要的G+致病菌，它可以引起多種不同的化膿性疾病和非化膿性感染后遺癥的產(chǎn)生。巨噬細(xì)胞是固有免疫中的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過其模式識(shí)別受體(PRR)與細(xì)菌表面的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)。其中模式識(shí)別受體TLR活化后可以與接頭蛋白MyD88作用，進(jìn)一步激活TRAF6來調(diào)節(jié)NF-KB和MAPKs信號(hào)通路。NF-κB激活后轉(zhuǎn)位入核，通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄

2、因子、急性期蛋白和細(xì)胞因子等多種物質(zhì)的表達(dá)來調(diào)控免疫反應(yīng)以適應(yīng)細(xì)胞生存。鋅指蛋白A20是一種免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子，在多種細(xì)胞受到LPS、TNF、CD40等刺激后可大量表達(dá)，以發(fā)揮雙重泛素化酶作用。既能介導(dǎo)目的蛋白被蛋白酶體降解，又能抑制泛素化依賴信號(hào)的傳導(dǎo)。其泛素化作用的底物包括:TRAF2、TRAF6、IKK、Caspase8、RIP1等。本室前期研究表明:GAS作為G+菌其活化巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)較G-菌微弱而遲滯，同時(shí)還伴隨負(fù)調(diào)節(jié)蛋白A2

3、0的高表達(dá)。1為了探究這種高表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，是否與其導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)低下相關(guān)，本研究中以E.coli作為G-菌的對(duì)照，GAS刺激鼠源巨噬細(xì)胞RAW267.4后分別檢測(cè)細(xì)胞因子、NF-κB、TRAF6及A20在不同時(shí)間點(diǎn)核酸以及蛋白水平表達(dá)的差異。2為進(jìn)一步證實(shí)A20高表達(dá)與炎癥反應(yīng)低下有關(guān)，A20SiRNA借助脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，通過形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，

4、RISC)，特異性的降解A20的mRNA，從而導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄后基因沉默。3用GAS感染A20SiRNA預(yù)處理后RAW264.7細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞因子、NF-κB、TRAF6基因和蛋白水平的變化，對(duì)比A20SiRNA預(yù)處理組和不同對(duì)照組之間的差異，為GAS感染后通過巨噬細(xì)胞介導(dǎo)微弱而遲緩的炎癥反應(yīng)，來逃避宿主固有免疫系統(tǒng)的清除作用提供理論依據(jù)。4為了探究GAS感染巨噬細(xì)胞后A20的高表達(dá)是否與MyD88通路激活相關(guān)，用GAS或E.coli刺激My

5、D88-/-C57BL/6鼠和野生C57BL/6鼠BMDM細(xì)胞后，應(yīng)用Western blot檢測(cè)NF-κB、TRAF6、A20表達(dá)的變化。
　　方法:
　　1.RAW264.7細(xì)胞分別接受GAS或E.coli刺激，用Real-time PCR、CBA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。
　　2.應(yīng)用Western blot檢測(cè)NF-κB、TRAF6、A20在GAS或E.coli分別

6、刺激RAW264.7細(xì)胞和野生C57BL/6鼠BMDM細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的變化情況。
　　3.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，借助脂質(zhì)體將A20SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞而后GAS感染，行Western blot、BCA、Real-time PCR分別檢測(cè)A20特異性的干擾后NF-κB、TRAF6以及細(xì)胞因子蛋白和基因水平的變化。
　　4.GAS或E.coli刺激MyD88-/-C57BL/6鼠和野生C57BL/6鼠BMDM細(xì)

7、胞后，應(yīng)用Western blot檢測(cè)NF-κB、TRAF6、A20表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況:GAS刺激組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)在7小時(shí)以內(nèi)低于E.coli刺激組，而IL-10的量卻高于E.coli組。其中炎癥因子:IL-1β、TNF-α分別都在3-5小時(shí)達(dá)高峰;而IL-6、IL-10的量分別在7小時(shí)左右達(dá)高峰。
　　2.CBA檢測(cè)培養(yǎng)上

8、清中細(xì)胞因子的表達(dá):GAS刺激組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子的表達(dá)量都比E.coli刺激組低，這與Real-time PCR的檢測(cè)結(jié)果基本一致。
　　3.Western blot檢測(cè)GAS或E.coli分別刺激RAW264.7細(xì)胞后NF-κB、TRAF6、A20的變化:GAS刺激后，A20從2小時(shí)開始表達(dá)明顯升高，6、8小時(shí)達(dá)高峰;E.coli刺激后，A20從4小時(shí)開始表達(dá)，6、8小時(shí)達(dá)高峰。并且GAS刺激A20的表達(dá)明顯高于E.coli

9、刺激組，而A20所調(diào)控的下游分子TRAF6，以及核轉(zhuǎn)錄因子P65的表達(dá)則相應(yīng)降低，在GAS刺激組低于E.coli刺激組。用C57BL/6鼠的BMDM細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果一致且更為明顯。
　　4.A20SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，隨后，以等量GAS刺激該細(xì)胞以檢測(cè):
　　A20、TRAF6及P65的表達(dá)，結(jié)果顯示，A20SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)入RAW264.7細(xì)胞后，無論基因水平還是蛋白水平檢測(cè)不到A20的表達(dá)。該細(xì)胞

10、受GAS刺激后，P65、TRAF6表達(dá)顯著升高，且炎癥反應(yīng)劇烈，細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10表達(dá)明顯升高。
　　5.Western blot檢測(cè)MyD88-/-C57鼠和野生C57BL/6鼠BMDM細(xì)胞受GAS和E.coli刺激后A20的表達(dá)，結(jié)果顯示:盡管MyD88-/-C57鼠BMDM細(xì)胞受到刺激，A20幾乎不表達(dá)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生C57BL/6鼠BMDM細(xì)胞受到刺激后的高表達(dá)。
　　結(jié)論: