豬鏈球菌2型IgG結(jié)合蛋白的功能研究.pdf

1、鏈球菌（Streptococcus suis）是一種重要的豬病病原體，能引起豬疫病，臨床上能引起豬的高熱、腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)癥狀等。該菌有33個血清型，其中豬鏈球菌2型（SS2）流行最廣、且致病性最強(qiáng)，并能感染人，是一種重要的人畜共患病病原。目前對SS2研究較多，但其在宿主體內(nèi)如何生存、繁殖并成功侵染宿主的機(jī)制還不清楚。豬鏈球菌IgG結(jié)合蛋白（SSPG）是一種可與多種動物IgG結(jié)合的細(xì)胞壁蛋白，廣泛地存在于豬鏈球菌的各個血清型

2、當(dāng)中，被認(rèn)為是共同抗原。然而其在豬鏈球菌中的生物學(xué)意義并不清楚。本實驗的目的在于采取多種手段探求SSPG與SS2在致病力上的相關(guān)性，具體內(nèi)容如下：
　　 1．SSPG的克隆表達(dá)純化及其免疫學(xué)特性的初步研究
　　 SSPG與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用可能是豬鏈球菌在感染中逃避免疫監(jiān)視，造成宿主全身性感染的重要原因，也可能是與豬鏈球菌致病力大小密切相關(guān)的因子。利用純化的SSPG并探求其免疫學(xué)特性，有利于發(fā)現(xiàn)SSPG與豬鏈球菌致病

3、力的關(guān)系。
　　 實驗用PCR的方法從豬鏈球菌1/2、1、2和9型菌株基因組中擴(kuò)增SSPG基因，構(gòu)建pET-28a-SPG重組表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21菌株。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE及Western blotting鑒定為可高效表達(dá)。鎳親和層析及分子篩兩步純化后獲得純度較高的目的蛋白。Western blotting及ELISA試驗結(jié)果表明，所有純化的目的蛋白均可與不同動物的IgG結(jié)合，其中與人和

4、豬IgG的結(jié)合能力相對較高，但不同血清型豬鏈球菌SSPG與同種動物IgG的結(jié)合活性沒有明顯差異。
　　 實驗將豬鏈球菌2型的SSPG以腹腔注射的方式刺激小鼠脾細(xì)胞，并將SSPG與具有較強(qiáng)免疫保護(hù)性的溶血素蛋白（SLY）和溶菌酶釋放蛋白（MRP）混合免疫小鼠后檢測免疫保護(hù)力，實驗結(jié)果顯示SSPG并非超抗原物質(zhì)，雖然可以引起機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體水平，但可能并不是免疫保護(hù)性蛋白，同時可能抑制了免疫保護(hù)性抗原的保護(hù)力水平。
　　

5、2．豬鏈球菌2型SSPG基因缺失突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性
　　 豬鏈球菌在感染過程中逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和吞噬，并對抗宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制對研究豬鏈球菌的致病機(jī)理具有十分重要的意義。金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）等IgG結(jié)合蛋白都被證明與病原菌的致病性具有密切聯(lián)系，且大多與病原菌逃避宿主的免疫監(jiān)視有關(guān)。
　　 為了進(jìn)一步探求SSPG是否如一些報道中預(yù)測一樣能夠影響豬鏈球菌的致病性，實驗利用溫度敏感型載體pSET4s，進(jìn)

6、行鏈球菌的重組，將豬鏈球菌2型的SSPG基因敲除，構(gòu)建了SSPG基因缺失的鏈球菌突變株。對突變菌株的生物學(xué)特性分析顯示，突變菌株的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)在透射電鏡的觀察下界限較為模糊，但其表面形態(tài)、溶血活性、生化特性以及染色特性等與野生菌株相比均無明顯差異。細(xì)菌生長曲線的繪制結(jié)果表明突變菌株生長的衰亡期出現(xiàn)較早，SSPG的缺失可能影響了細(xì)菌生長的穩(wěn)定性。小鼠攻毒實驗的結(jié)果表明SSPG基因的缺失對豬鏈球菌的致病性沒有顯著影響，但可能影響了豬鏈球菌在宿