豬鏈球菌PCR檢測(cè)方法的建立及纖連蛋白結(jié)合蛋白的克隆和表達(dá).pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis,SS)是重要的人獸共患病的病原，能引起豬和人類的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎以及突發(fā)性死亡，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。迄今為止，根據(jù)SS英膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)抗原性的不同，可將其分為35個(gè)血清型(1～34，l／2)，主要致病血清型為SSl、SS2、SSl／2、SS7、SS9和SSl4，其中以SS2流行最廣、致病性最強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，并不是

2、所有的SS2都有致病性，菌株致病性強(qiáng)弱與其是否表達(dá)毒力相關(guān)因子有很大關(guān)系。目前，已知的與SS致病性相關(guān)的毒力因子主要有英膜多糖、溶菌酶釋放蛋白(muraminidase releasedprotein,MRP)、胞外因子(extracellular factor,EF)、溶血素(suilysin,Sly)、和IgG結(jié)合蛋白、44000的蛋白等，在SS致病方面一般都是協(xié)同發(fā)揮作用。對(duì)于SS檢測(cè)和分型，國(guó)內(nèi)研究主要針對(duì)SS2，所以本試驗(yàn)第一

3、部分中，根據(jù)Genbank中g(shù)dh、cpsl、cps2、cps7、cps9和mrp、epf(epf<'*>)、sly設(shè)計(jì)引物建立兩個(gè)多重PCR，希望實(shí)現(xiàn)對(duì)SS系統(tǒng)的檢測(cè)。此外，近年來發(fā)現(xiàn)SS一種新的毒力因子—纖連蛋白結(jié)合蛋白。作為一種值得重視的細(xì)菌非菌毛黏附素，它普遍存在于SS的除32和34型以外所有血清型中。有研究說它可以作為交叉保護(hù)性抗原，有望用于SS的檢測(cè)和免疫等方面。本試驗(yàn)第二部分是以四川資陽人源分離株為模板進(jìn)行的表達(dá)純化等工作

4、。1SS及其主要致病血清型多重PCR檢測(cè)方法的建立根據(jù)SS谷氨酸脫氫酶基因和血清型1型、2型、1／2型、7型、9型和14型英膜多糖編碼基因核酸序列，分別設(shè)計(jì)SS型通用引物和型特異性引物，建立、優(yōu)化多重PCR檢測(cè)方法，并檢測(cè)分析種屬背景明確的菌株73株(其中豬鏈球菌49株、其他對(duì)照菌株24株)及臨床分離樣本94株(包括四川資陽人源和豬源臨床分離樣本45株)。其中73株種屬背景明確菌株多重PCR種檢測(cè)結(jié)果符合率為87.5％，6種主要致病血清

5、型檢出率可達(dá)率為100％。24株對(duì)照菌株在種和血清型水平均檢測(cè)為陰性。對(duì)45株四川豬鏈球菌病暴發(fā)現(xiàn)場(chǎng)分離菌株進(jìn)行檢測(cè)，其中41株為SS2。上述結(jié)果提示本試驗(yàn)建立的多重PCR方法，可確定被檢測(cè)SS是否屬于主要致病血清型，特異性和敏感性好，可用于豬鏈球菌病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。 2 豬鏈球菌2型及其主要毒力因子多重PCR檢測(cè)方法的建立 研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有的SS都有致病性，菌株致病性強(qiáng)弱與其是否表達(dá)毒力相關(guān)因子有很大關(guān)系

6、。有鑒于此，本研究擬建立多重PCR檢測(cè)方法，旨在實(shí)現(xiàn)多種主要毒力相關(guān)因子基因的同步檢測(cè)。根據(jù)ss毒力相關(guān)因子基因cps、mrp、epf和sly序列，設(shè)計(jì)和合成4對(duì)特異性引物，擴(kuò)增目的片段預(yù)期大小分別為557bp、970bp、744bp(1396 bp、1622 bp、2431 bp、2655 bp、3111 bp)和622 bp。通過擴(kuò)增體系和條件優(yōu)化，建立了多重PCR體系，并對(duì)72株(其中48株為豬鏈球菌，24株為其他群的鏈球菌)種屬

7、資料確定的分離菌株和臨床分離樣本94株(包括四川資陽人源和豬源臨床分離樣本45株)進(jìn)行檢測(cè)分析。48株SS中，cps2檢出率為16／48、mrp檢出率為14／48、epf檢出率為12／48、epf<'*>檢出率為3／48、sly檢出率為26／48，上述檢測(cè)結(jié)果與背景已知菌株的毒力因子表達(dá)情況完全相符；四川豬鏈球菌病爆發(fā)現(xiàn)場(chǎng)分離的45株菌株中，41株為豬鏈球菌2型；24株種屬已知菌株(大部分為其他群鏈球菌及金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、流感嗜

8、血桿菌等)和49株豬源鏈球菌的臨床分離樣本毒力因子檢測(cè)結(jié)果均為陰性。建立的多重PCR可用于ss毒力相關(guān)因子cps2、mrp、epf,sly的檢測(cè)，特異性和敏感性好，為SS主要毒力因子快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了快速、可靠的方法。 3 豬鏈球菌2型四川人源分離株ZYH18纖連蛋白結(jié)合蛋白基因的克隆和序 列分析 針對(duì)05年SS2四川資陽人源分離株ZYHl8纖連蛋白結(jié)合蛋白(FBPS)基因進(jìn)行克隆和序列分析。以ZYH18

9、的基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增出纖連蛋白／血纖蛋白原結(jié)合蛋白基因片段，克隆于pMD-T18載體，構(gòu)建成載體pMD-T-fbps，轉(zhuǎn)化到宿主菌TG1中，進(jìn)行序列測(cè)定(GenBank登錄號(hào)為DQ345444)。測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室保存的其他7株SS2臨床分離菌株測(cè)序結(jié)果及GenBank提交序列AF438158進(jìn)行編碼區(qū)基因的同源性比對(duì)。實(shí)驗(yàn)室保存的8株SS2的FBPS編碼區(qū)基因同源性高達(dá)100％，并無分離時(shí)間和地點(diǎn)上的差異；與GenB

10、ank提交序列AF438158同源性為99％，僅存在兩個(gè)氨基酸的不同。 4 纖連蛋白結(jié)合蛋白克隆和表達(dá) 根據(jù)SS2四川資陽人源分離株ZYH18纖連蛋白結(jié)合蛋白(FBPS)基因序列分析結(jié)果，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)表達(dá)引物，以ZYH18基因組為模板，對(duì)fbps基因247-1969位序列擴(kuò)增，以pGEX4T-2為載體，轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)分子量約為86kD的融合蛋白。免疫轉(zhuǎn)印分析表明，該融合蛋白具有FBPS的抗